细胞凋亡技术-生物探索.PDF

细 胞 凋 亡 技 术 细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡（Programmed cell death 简称 PCD），是 细胞衰老自然死亡的主要方式之一，在机体中承担着重要的调控作用。它不仅在维持细胞群 体数量的稳定、胚胎发育和免疫系统的克隆选择方面，而且在肿瘤发生、发展、抗肿瘤药物 的治疗等方面均具有十分重要的作用。 细胞凋亡是由基因编程控制的细胞主动参与的自杀过程，是一种生理性调节机制，与细 胞坏死的死亡机制是完全不同的，与细胞凋亡相关的癌和抑癌基因有两类，一类是促进凋亡 的如 C-myc、野生型 P53、Fas 和Fasl、bcl-xs、bax、ICE、bak、bad 等；另一类是抗细胞 凋亡的基因，如突变型 P53、bcl 家庭的 bcl-2、bcl-XL 及病毒来源的 BHRF1 等，这两类基 因与调控细胞凋亡密切相关，在肿瘤研究中，如果促凋亡基因活化和高表达，将会导致肿瘤 的发生和恶化，用药后受抑，表明药物疗效好，预后佳，肿瘤发生与发展受抑制。反之，若 促凋亡基因受抑，肿瘤发生和发展恶化。如果抗凋亡的基因活化和高表达将促进肿瘤的发生 与发展，会导致肿瘤细胞耐药、预后不良；反之肿瘤的发生与发展受抑，对放/化疗敏感， 疗效好。由此可见，研究细胞凋亡不仅对研究组织和细胞的分化有理论研究价值，而且对肿 瘤的发生和发展及临床治疗均有指导意义。 一、细胞凋亡的特征 细胞凋亡的特征是内源性核酸内切酶的激活，染色质DNA被有规律地切成整数倍的核小 体片断，凝胶电泳呈梯形图像，电镜下可见有形态学变化，如细胞邹缩，胞膜完整，胞浆致 密，染色质浓缩成新月形并断裂，有核膜包绕含核碎片的凋亡小体形成。经DAPI即 4-6-二 脒基二苯基吲哚(4.6-diamido-2-phenylindole hyodrochloride)荧光染色，可见有细胞固 缩，核断裂后形成大小不等的块状或颗粒状的荧光碎片。由于核断裂后形成的小片断可透过 膜而丢失，仅剩下大片断在流式细胞检测细胞周期时可测出，称“G1”期的AP峰（即凋亡峰）。 细胞死亡包括坏死和凋亡两种形式，两者区别如表 13-1 所示。 表 13-1 细胞坏死与凋亡的区别 凋 亡 (Apoptosis) 坏 死(Necrosis) （1）、定义：一种与遗传机制有关的(即由 外在的致损伤因素作用达到一定强度， 基因调控的)主动的、自发死亡的 持续一定时间后所导致的细胞死亡（被 方式，无炎症反应。 动），有炎症反应。 （2）、形态学观察 细胞核：核浓缩、碎裂(染色质浓缩→ 核溶解(无规律的染色质团块→溶解) 有规律性、断裂成核碎片)，有新月形 无规律性。 凋亡小体。 细胞器：完整 崩解 细胞膜：完好 尚失去完整性 细胞体积：细胞浓缩 细胞肿胀 在组织中：常呈单个细胞发生 常成群细胞发生 （3）、生物化学检测 核DNA有规律断裂50～300kb /或180 bp 左右的片断 DNA 无规律地断裂 凝胶电泳：呈梯形条带(ladder) 条带不清（smears） DAPI 萤光染色，片状、颗粒状核荧光。 无颗粒或片状核荧光出现 流式细胞仪检测：可见亚G1峰(AP峰) 无此峰 核基因表达：必须 ——