电泳缓冲液pH83Tris.ppt

* 5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 5.1 参考一抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释一抗。5.2 吸尽封闭液后，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育1～2小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。5.3 回收一抗。然后加入Western洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 6.1 参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 6.2 吸尽洗涤液后，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育1～2小时。 6.3 回收二抗。然后加入Western洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 前2步洗涤是为了洗去一抗和二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。洗涤液使用 TBST 或者 PBST，其中的 Tween20 有助于去除非特异性的结合，减少背景。同时短时间多次的洗膜（如 5-6次，每次 3分钟）比长时间少次数的洗膜更有效。 第3步TBS洗涤是为了洗去膜上的Tween20，因为它可以阻碍底物的沉积。 一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。 * 7. 蛋白检测(Detection of proteins) 在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺(luminol，氨基苯二酰一肼)并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。 ① HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存②?AKP标记二抗用AP显色，在10mlAKP缓冲液中加入66micro;lNBT溶液和33micro;l BCIP溶液混匀，室温下将膜放入显色（37℃可加速反应）5-15min。对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。③底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（荧光在一段时间后会越来越弱，要控制好时间） 除了酶连二抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，比如：荧光素异硫氰酸盐标记的二抗（可通过紫外灯产生荧光）；生物素结合的二抗等等。 * 8. 膜的重复利用(Membrane recovery) 如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。 两种方法都不能去除由显色检测系统产生的有色沉淀物（例如BCIP、4-CN、DAB和TMB）。然而，仍可以用针对不同靶蛋白的特异性抗体分析印迹膜。 重要提示：在各次免疫检测之间不应使印迹膜干燥。印迹膜干燥将会使任何剩余抗体与膜永久性结合。 通过加热和去污剂进行解吸 仪器和溶液： 解吸液：100mM 2-巯基乙醇，2%（w/v）SDS，62.5 mM Tris-HCl，pH6.7 磷酸盐缓冲液（PBS）：10mM 磷酸钠，pH7.2，0.9%（w/v）NaCl 浅托盘，大小足以将膜放入其中。 操作： 1. 在通风橱中，将印迹膜放入解吸液中在50℃下振摇30分钟。 2. 将印迹膜放入缓冲液中振摇10分钟。用新缓冲液重复漂洗两次。 3. （可选）重复起始检测方法（忽略一抗步骤），确保已灭活抗体或已从膜上解吸抗体。 4. 将印迹膜放入缓冲液中振摇10分钟。 5. 继续下一轮检测的封闭步骤。 酸解吸 仪器和溶液： 解吸液：25mM 甘氨酸- HCl，pH2，1%（w/v）SDS 磷酸盐缓冲液（PBS）：10mM 磷酸钠，pH7.2，0.9%（w/v）NaCl 浅托盘，大小足以将膜放入其中。 操作： 1