无菌检查方法学验证精选.ppt

2006年8月 * 当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查。 实验时，以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 2006年8月 * 四、凝胶法 ----凝胶限量试验 检验供试品中的内毒素含量是否小于限值的定性方法。 每批供试品必须做 2支供试品管 2支供试品阳性对照 同时 每次实验须做2支阳性对照和2支阴性对照。 2006年8月 * 编号 内毒素浓度/配制内毒素的溶液 平行管数 A 无/供试品溶液 2 供试品溶液 B 2λ/供试品溶液 2 供试品阳性对照 C 2λ/检查用水 2 阳性对照 D 无/检查用水 2 阴性对照 当阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。 2006年8月 * 例：替硝唑注射液 ，计算限值为0.5 EU/ml，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验，计算 MVD=1.0ml/ml?0.5 EU/ml÷ 0.125 EU/ml=4倍 供试品溶液 供试品阳性对照 阴性对照 阳性对照 供试品溶液： 4倍替硝唑稀释液 供试品阳性对照为：含0.25EU/ml标准内毒素的4倍替硝唑稀释液 阳性对照为：浓度为0.25EU/ml的标准内毒素溶液 2006年8月 * 例：替硝唑注射液 ，计算限值为0.5 EU/ml，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验，计算 MVD=1.0ml/ml?0.5 EU/ml÷ 0.125 EU/ml=4倍 供试品溶液 供试品阳性对照 阴性对照 阳性对照 试验有效 2006年8月 * 有效稀释浓度（MVC）的计算 MVC= λ/L 目前市售鲎试剂灵敏度λ在0.03~0.5 EU/ml 样品S的对应有效稀释浓度为 C0.03=0.03/0.015=2.08U/ml C0.06=0.06/0.015=4.15U/ml C0.125=0.125/0.015=8.30U/ml C0.25=0.25/0.015=16.6U/ml C0.5=0.5/0.015=33.3U/ml 2006年8月 * 实验操作 将样品S用细菌内毒素检查用水分别稀释浓度为66.6、33.3、16.6、8.3、4.15、2.08U/ml的溶液，将此系列浓度溶液记为NPC。 同时在上述试验液中加入细菌内毒素标准溶液，使每一浓度的试验液中均含有2λ浓度的细菌内毒素，记此系列溶液为PPC。 2006年8月 * 取灵敏度为0.25Eu/ml的厂家的鲎试剂， 与上述PPC和NPC进行反应，每一浓度重复两管，并设阳性和阴对照。 结果见下表 2006年8月 * 样品S干扰预试验鲎试剂灵敏度λ= 0.25Eu/ml  样品 样品浓度（U/ml） 66.6 33.3 16.6 8.30 4.15 2.08 NC 01 反应结果 NPC -- -- -- -- -- -- -- PPC -- -- ++ ++ ++ ++ ++ 02 NPC -- -- -- -- -- -- -- PPC -- -- ++ ++ ++ ++ ++ 03 NPC -- -- -- -- -- -- -- PPC -- -- ++ ++ ++ ++ ++ 2006年8月 * 样品S干扰预试验鲎试剂灵敏度λ= 0.125Eu/ml  样品 样品浓度（U/ml） 66.6 33.3 16.6 8.30 4.15 2.08 NC 01 反应结果 NPC -- -- -- -- -- -- -- PPC -- -- ++ ++ ++ ++ ++ 02 NPC -- -- -- -- -- -- -- PPC -- -- ++ ++ ++ ++ ++ 03 NPC -- -- -- -- -- -- -- PPC -- -- ++ ++ ++ ++ ++ 2006年8月 * 由以上预干扰试验结果可以初步了解：两个厂家鲎试剂对样品S的细菌内毒素的试验结果均在16.6U/ml以下浓度时无抑制干扰。 2006年8月 * 正式干扰试验 为了最终确认是否存在抑制因素的影响，进行以下正式干扰试验。 取样品S用细菌内毒素检查水分别进行稀释 ，使其最终干扰试验浓度为8.3U/ml，按中国药典二部附录中的细菌内毒素检查供试品干扰试验项进行实验， 2006年8月 * 样品溶液的干扰试验（湛江安度斯生物有限公司鲎试剂 λ=0.125Eu/ml ） 样品 内毒素浓度EU/ml 0.25 0.125 0.06 0.03 NC Es(EU/ml) Et(EU/ml ) 水溶液 ++++ ++++ ++++ ---- -- 0.06 01 +++