龙军真菌讲稿4推荐.ppt

酵母菌纸片扩散法敏感试验 (CLSI)M44-P M44-P 酵母菌纸片扩散法敏感试验方案，制定了氟康唑(fluconazole)和沃尔康唑(voriconazole)质控株的参考范围及氟康唑的抑菌环解释标准 研究证实氟康唑对酵母菌药敏试验有较好的重复性，可准确地检测酵母菌对氟康唑的敏感性 * * ROSCO 酵母菌纸片扩散法 改良Shadomy琼脂或RPMI 1640琼脂加热溶解后倒入9cm平皿（20ml） 新鲜具活力的纯化的酵母菌落以生理盐水制成5*105FU/ml(配制成0.5麦氏浊度后再以生理盐水对倍稀释) 接种：平皿先置35℃干燥20－25分钟，倾注0.5ml菌液于平皿表面，均匀涂布，用移液管吸除多余的菌液35℃干燥15分钟后贴上药物纸片 培养：35℃ 18－24小时，如未见明显生长，再放24小时。隐球菌：30℃ 42－48小时 * * 结果判读 氟康唑、酮康唑、氟胞嘧啶： ≥20mm 敏感 12-19mm 中介≤11 耐药 两性霉素B 、伊曲康唑、制霉菌素: ≥15mm 敏感 10-14mm 中介 无抑菌圈 耐药 * * E-test法 是一种商品化的抗真菌药物敏感性方法 采用被不同量的抗真菌药物包被的特殊试 剂条，受试药物包括氟康唑、伊曲康唑和 两性霉素B等 ? 该方法操作简单、直观，与NCCLS法有较好 的一致性 ? 缺点：结果判定需有一定经验，价格昂贵 * * E-test法 基本原理：用特殊技术将抗菌药物在一试剂条上形成一个定量连续梯度,其培养基、菌接种浓度、培养温度及时间等条件基本按照M-27方案所推荐的条件E-test法已被用于某些霉菌如曲霉属、镰刀菌属和根霉属的药敏检测 * * E-test法 E-test抗真菌药敏试条：? 二性霉素B(AP)? 5氟胞嘧啶(5-FC)? 酮康唑(KE)? 伊曲康唑(IT)? 氟康唑(FL)? 起始浓度:32mg/L终末浓 度:0.002mg/L * * 丝状真菌的E-test药敏试验 * * 流式细胞检测法 原理:检测不同药物浓度作用下各药物浓度管的荧光强度，根据荧光强度的梯度变化趋势，判定药物抗菌活性的一种方法 对流动液体中排列成单列的细胞和颗粒进行检测，分析其光散射和荧光，从体积、内部结构等物理及化学特征判断真菌活力和功能状态。 * * 深部真菌感染存在的问题—总结 真菌广泛定殖于人体的各个部位及存在于周围环境中，在免疫缺陷者引起感染。 临床医师诊断困难：没有典型症状和体征 缺乏良好的检查方法，或检查的价格昂贵 临床医师送检的标本不注重真菌的监测 送检的标本不合乎真菌检验的要求 实验室的检测阳性率不高，如血培养（30-50%） 实验室的结果在临床上难以解释：污染？定植？致病？ * * 曲霉菌的生长速度非常快，更迫切需要早期、及时的诊断治疗 1-2 mm/小时 * * 原来照片位置 * * * * 分子生物学技术 目前缺乏标准化的方法 WHite运用实时定量PCR方法对203例血液病患者全血标本进行曲霉检测，结果发现在确诊/高度拟诊的患者中，阳性率为92.3%;与G实验和GM实验及高分辨CT有良好的一致性 * 分子生物学技术 台湾学者运用液相芯片技术，基于所有真菌的高度保守序列如18S、28S和高度可变的内部转录间隔区(ITS) ，前者用于筛选真菌感染，后者用于菌种的确定，同时对64种真菌进行鉴定，敏感性和特异性均大于97% ， 1天内完成 J Clin Mic 2005,43:3760-3768 * * 分子生物学技术 存在问题 1.外来的污染 2.不能有效地区分定植和感染 3.不能指导临床何时开始及停止抗真菌治疗 * * 真菌的病理检查 * * 真菌的病理检查 PAS阳性的念珠菌菌丝 * * 真菌的病理检查 HE染色 真菌菌丝 * * 真菌的病理检查 肺隐球菌PAS阳性 * * 组织病理学检查 侵袭性曲霉感染： －侵犯血管，引起病变部位的栓塞、出血及坏死 －非特异性炎症、化脓性改变或肉芽肿形成 * * 组织病理学检查 组织内曲霉： －镜下菌丝常呈45°分枝、有隔、透明且粗细均匀,直径约3～6μm ,有菌丝反复分枝现象，排列成放松射状或珊瑚状。 －有些慢性损害中菌丝常呈不规则扭曲状 －特征性的菌丝：诊断曲霉感染最可靠的依据 * * 组织病理学检查 HE染色呈蓝色略带红色，PAS染色呈红色 嗜银染色呈黑色 菌丝横切面与孢子的鉴别：