线粒体DNA在α粒子致人支气管上皮细胞体外恶性转化中的作用汇总.pdfVIP

线粒体DNA 在α 粒子致人支气管上皮细胞体外恶性转化中的作用 中文摘要 中文摘要 目的：研究线粒体DNA （mitochondrial DNA ，mtDNA ）在α 粒子致人支气管 上皮细胞（human bronchial epithelial cells ，HBE ）体外恶性转化中的作用，并探讨 mtDNA 参与α 粒子致HBE 凋亡抵抗的机制。 方法：（1）采用溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr ）诱导法构建mtDNA 拷贝 - 数降低的HBE 细胞株（HBE ρ ）。通过营养缺陷、real-time PCR 、mtDNA 染色鉴 - 定mtDNA 的缺失情况来验证HBE ρ 。绘制细胞生长曲线以分析细胞生长速率。 采用生化试剂盒检测细胞色素C 氧化酶（cytochrome c oxidase，COX ）的活性。 利用JC-1 荧光探针染色，检测分析细胞内线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential ，∆Ψm ）。H DCFDA 染色法检测细胞内活性氧（reactive oxygen species ， 2 + - ROS ）的水平。（2 ）不同剂量（0、0.3、0.6 Gy ）的α 粒子照射HBE ρ 与ρ ，传代 培养至20 代（Passage 20 ，P20 ）、40 代（Passage 40 ，P40 ）。检测照射后的细胞在 软琼脂中的独立锚着性生长能力，细胞划痕实验观察细胞的迁移/侵袭特性。平板 克隆形成实验分析细胞群体依赖性和增殖能力。运用流式细胞术，采用三种不同 的方法分析细胞的凋亡率：JC-1 荧光染色法，测定JC-1 单聚体的比例；Annexin + - + + V-FITC/PI 双染色法，分析Annexin /PI 比例(早期凋亡率) 、Annexin /PI 比例(晚期 凋亡/坏死率) ；PI 单染法，分析%subG1 。通过绘制生长曲线，比较细胞增殖速率。 + - 以PI 染色分析细胞周期分布。（3 ）α 粒子照射后的HBE ρ 与ρ 传代培养至P20 、 P40 ，Western blotting 分析蛋白Bax、Bcl-2 、cyt-c、caspase-9、caspase-3、caspase-8 的表达水平。Real-time RCR 分析mtDNA 拷贝数的差异。H DCFDA 荧光探针检测 2 细胞内ROS 的水平。 结果：（1）50 ng/ml EtBr 诱导9 d 及12.5 ng/ml EtBr 诱导30 d 后的HBE 在ρ0 筛选培养基中，漂浮死亡；Real-time PCR 结果显示，其 mtDNA 拷贝数降低了 76.01% ；mtDNA 染色法，观察到诱导后的细胞的mtDNA 染色微弱、数量减少。 - 以上三点表明，EtBr 诱导法已构建了mtDNA 拷贝数降低的 HBE 细胞株（HBE ρ ）。 + - 与母本HBE ρ 相比，HBE ρ 的生物学性状发生了改变：COX 活性降低，氧化呼吸 链损伤，生长速率减慢， ∆Ψm 与ROS 水平降低。（2 ）在α 粒子照射后