高致病性禽流感防治技术规范相关附件.doc

附件1 血凝抑制（HI）试验 流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体的结构，HA试验由此得名。HA蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。 该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。 HA-HI试验的优点是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法，可用来鉴定所有的流感病毒分离株，可用来检测禽血清中的感染或免疫抗体。它的缺点是只有当抗原和抗体HA亚型相一致时才能出现HI象，各亚型间无明显交叉反应；除鸡血清以外，用鸡红细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异凝集素，对于其它禽种，也可以考虑选用在调查研究中的禽种红细胞；需要在每次试验时进行抗原标准化；需要正确判读的技能。 1? 阿氏（Alsevers）液配制 称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。 2? 10%和1%鸡红细胞液的制备 2.1采血? 用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。 2.2 洗涤鸡红细胞? 将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。 2.3? 10%鸡红细胞悬液? 取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。 2.4? 1%鸡红细胞液? 取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL，加入9 mL生理盐水，混合均匀即可。 3 抗原血凝效价测定（HA试验，微量法） 3.1 在微量反应板的1孔～12孔均加入0.025mL PBS，换滴头。 3.2吸取0.025mL病毒悬液（如感染性鸡胚尿囊液）加入第l孔，混匀。 3.3从第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。 3.4每孔再加入0.025mL PBS。 3.5每孔均加入0.025mL 体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）见附录B。 3.6振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下反应1小时）。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。 3.7结果判定? 将板倾斜，观察血凝板，判读结果（见下表）。 表1：血凝试验结果判读标准 类别 孔? 底? 所? 见 结果 2 3 4 5 红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细胞凝集 红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈 红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块 红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块 红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集 ++++ +++ ++ + - ? 能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）。注意对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次检验无效。 4 血凝抑制（HI）试验（微量法） 4.1 根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。 4.2 在微量反应板的1孔～11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。 4.3 吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。 4.4 1孔～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温（约20℃）静置至少30min。 4.5 每孔加入0.025mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下进行），对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。 4.6 结果判定 以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。 只有阴性对照孔血清滴度不大