二研-2010年 VII因子.pptVIP

S S FVIIa FVIIa是一种依赖维生素K的凝血因子 FVIIa可作为一种广泛应用的止血剂,其可使出血患者的局部止血的迅速启动 用于治疗FVII缺乏症导致的出血病症，外 科手术的出血，血友病等, 用于治疗存在有因子VIII（FVIII）和因子IX（FIX）抗体（抑制物）的先天性血友病和继发性血友病患者的自发性或手术性出血 CHO表达系统 哺乳动物细胞是表达具有天然活性的哺乳动物蛋白的最佳宿主 中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 成纤维细胞 既可以贴壁生长，也可以悬浮生长 二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株 具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化 课题设计 Recombinant plasmid DNA pSGHV0 Promoter SRα protein pDRHF Tissue-culture cells selection Electroporated 200V 950uF rCHO Amplification 鉴定，克隆扩增 挑取克隆 鉴定，克隆扩增 第三轮筛选 20nM MTX 50nM MTX 100nM MTX 第二轮筛选 第一轮筛选 挑取克隆 结构D western blot 　 　 　 无血清培养样品 　 　 　 　 405nm 8min 37℃ 活性检测 　 405nm 10min 37℃ 活性检测 　 450nm ELISA 空白 0.0939 　 （－） 0.1408 　 CHO(-) 0.2781 CHO(-) 0.0994 　 10H 0.1637 　 样品1 0.6925 样品1 0.0919 　 12A 0.1649 　 样品2 0.6835 样品2 0.0903 　 12C 0.1875 　 阳性 0.5861 样品3 0.0851 　 　 　 　 　 　 样品4 0.0877 　 　 　 　 　 　 样品5 0.0917 　 　 　 　 　 　 样品6 0.0874 　 　 　 　 　 　 样品7 0.086 　 　 　 　 　 　 阳性 0.5729 　 　 　 　 　 　 活性检测及ELISA检测 课题思路 结构A、B、C Selection I 　 （-） （+） 6#（无活性无Gla） C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 　 　 　 　 　 　 ELISA 0.247 0.499 0.464 0.494 0.447 　 　 　 0.412 0.395 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 活性检测1 107 43 51 11 21 　 　 　 24 24 　 　 　 　 　 军科院试剂盒 　 　 　 　 　 活性检测2 43 　 43 15 　 22 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 活性检测3 54 　 　 19 　 　 22 23 　 　 26 26 27 27 33 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 （-） （+） 6#（无活性无Gla） B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 　 　 　 　 　 　 　 　 ELISA 0.247 0.499 0.464 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 活性检测1 107 43 51 21 　 　 　 　 　 54 54 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 活性检测2 43 　 43 18 15 43 　 　 　 41 43 44 42 　 　 　 　 　 　 　 　 活性检测3 54 　 　 　 　 　 48 50 105 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 （-） （+） 6#（无活性无Gla） A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 ELISA 0.247 0.499 0.464 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 0.225 　 　 　 　 　 　 活性检测1 107 43 51 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 42 116 　 　 　 　 　 活性检测2 43 　 43 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 43 47 46 48 46 活性检测3 54 　 　 39 42 40 44 45 48 52 58 48 50 49 　 　 　 　 　 　 　 样品数 阳性数 阳性率 A 18 0 0.0% B 10 2 20.0% C 12 12 100.0% Western blot (selectionII 方案1） 方案2- CHO驯化 方案2-Sele