菁染料琥珀酰亚胺酯使用说明26.pdfVIP

菁染料琥珀酰亚胺酯使用说明 产品说明： 菁染料是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的，其琥珀酰亚 胺酯是最常用的脂肪氨基标记试剂，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检 测。通过改变次甲基链的长度，可改变其荧光发射波长，每增加一个双键，按照Huoffman 规 则正好红移约100nm。 菁染料Cy3 和Cy5 已成为基因芯片的首选荧光标记物；另外，Cy5， Cy5.5 和Cy7 的 吸收在近红外区背景非常低，是荧光强度最高、最稳定的长波长染料。特别适合于活体小动 物体内成像代替放射性元素。但由于菁染料，尤其是不对称菁染料的合成副反应多， 副产 物极性相近，产物的分离提纯相当困难。菁染料特别是水溶性菁染料分子极性大，分离提纯 越加困难。 图1. 脂溶性菁染料琥珀酰亚胺酯的结构式 图2. 水溶性菁染料琥珀酰亚胺酯的结构式 图3 菁染料琥珀酰亚胺酯的激发和发射波长光谱图 表1 菁染料琥珀酰亚胺酯的性质参数 Cy3 Cy3.5 Cy5 Cy5.5 Cy7 脂溶性菁染料 分子量 568.73 668.84 594.76 694.88 620.80 SE 水溶性菁染料 分子量 765.95 1234.54 791.99 1260.58 818.01 SE 最大吸收波长(nm) 552 581 650 678 750 摩尔吸光系数(M-1cm-1) 150000 150000 250000 250000 200000 最大发射波长(nm) 570 596 670 695 780 A280nm/Amax 8% 24% 5% 18% 11% 菁染料琥珀酰亚胺酯 （CyDye NHS）的标记： 菁染料和生物分子的比例F/P 4～12之间荧光强度最高， F/P值过高荧光探针会自我淬灭并 影响生物分子的生物活性，标记生物分子最好是用单琥珀酰亚胺酯，但是用双修饰的CyDye NHS并没有发现交联。CyDyeNHS标记抗体在pH (8.5～9.4)时10分钟F/P可达5～6，而在pH7.0 几乎不反应。我们用不同比例的Cy3标记anti-glutathione-S-transferase (GST)多克隆抗 体发现用1:1，5:1，10:1 和 20:1标记时得到的F/P值分别是 0.28:1，1.16:1，2.3:1和4.6:1。 操作步骤： 一、 水溶性Cy3 NHS标记anti-GST多克隆抗体 市场上买到的抗体如果含有其它蛋白（例如serumalbumin或gelatin等）或带氨基的缓 冲液会影响标记，在标记前需纯化。 1. 在1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗体(浓度为 0.5 mL at 3 mg/mL)，常温透析 4小时。 2. 在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再透析过夜。 3. 第二天用1 L 0.1 M NaHCO3 (pH 8.3)透析4小时。 4. 用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。 5. 用0.1MNaHCO3 稀释少量的抗体，在280nm处测其紫外吸收值计算标记抗体的总量 （IgG antibody摩尔吸光系数170 000 M-1 cm-1 at 280 nm). 6. 用DMSO配置Cy3 NHS (MW 765.95) 溶液浓度为10 mg/m