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实验十一 谷丙转氨酶活性的测定 实验原理 丙转氨酶（GPT）能催化丙氨酸和α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸在酸性条件下与2，4－二硝基苯肼可缩合生成丙酮酸二硝基苯腙，其在碱性条件下呈现棕红色，在一定的浓度下，颜色的深浅符合比尔定律，在520nm处有最大吸收。根据颜色的深浅，通过比色法可计算出酶活性。 应 用 GPT在肝脏中含量最多，当某种药物对肝脏早晨损害或病毒肝炎的急性阶段，由于肝细胞受损，GPT就释放到血液中，使血清中此酶水平明显升高。因此测定血清谷丙转氨酶的活性可作为诊断肝病的重要指标。 实验方法 1.标准曲线的制备 0 1 2 3 4 5 2mM丙酮酸标准溶液 （ml） 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 磷酸缓冲液（ml） 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 GPT底物溶液（ml） 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 A.取干净试管6支，编号后按照下表添加试剂。 B.将试管置于37℃水浴中保温10min，然后向每管中加入0.5ml2,4-二 硝基苯肼，再继续保温20min。 C.分别向各管中加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml，室温下静止10min。 D.用“0”号管作为空白对照，与520nm下测定吸收值。 E.以各管吸收值为纵坐标，丙酮酸的浓度为横坐标做标准曲线。 2.GPT活性的测定：取干净试管4支，按照下表添加试剂。 试剂 测定1 对照1 测定2 对照2 鱼肌肉匀浆液（ml） 0.25 0.25 0.25 0.25 GPT底物溶液（ml） 0.50 0.50 37 ℃水浴加热30min（转氨基反应） 2,4-二硝基苯肼（ml） 0.50 0.50 0.50 0.50 GPT底物溶液（ml） 0.50 0.50 37 ℃水浴加热20min（丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应） 0.4mol/L氢氧化钠溶液（ml） 5.00 5.00 5.00 5.00 各管反应完成后混匀，室温静止10min后，以对照管1或者对照2调节零点，测定1和2号管的吸收值。 实验数据计算 由标准曲线查出1号和2号反应管中的丙酮酸的量，根据下面的公式计算GPT的活性。 GPT活力单位的定义：单位时间（每小时）内，单位体积（每ml）的酶反应生成的产物的量（mM）。 GPT活力（单位）=反应管中丙酮酸的量（mM）/0.5小时×0.25ml 实验注意事项 1、在呈色反应中，2,4-二硝基苯肼与含有酮基的化合物反应形成苯腙。底物中的α-酮戊二酸可以与2,4-二硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。因此在制备标准曲线的时候需要加入一定量的底物以抵消α-酮戊二酸的影响。 2、严格按照实验步骤进行，温度和时间均要严格控制。 * *