植物钙离子浓度荧光定量检测试剂盒产品说明书（中文版）.docVIP

植物钙离子浓度荧光定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 钙离子浓度荧光定量检测试剂是一种旨在通过钙离子特异性荧光探针Fluo-4，与钙离子结合后，其荧光强度显著增强，在荧光分光光度仪下观察相对荧光峰值的变化，来测定组织裂解悬液中总钙离子浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等裂解萃取样品中总钙离子的浓度检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。 技术背景 钙是人体中的一种重要电介质和矿物质，占1150克。其中99％的钙以氟磷灰石钙（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨组织中。非骨组织钙成分主要存在于细胞内。钙具有两种主要形式：一种是非弥散型蛋白结合钙，其构成约40％至50％的血清中的总钙含量；另一种为弥散型游离钙，其进一步分成具有活性的复合钙（complexed calcium）和离子钙（ionized calcium）。钙对神经肌肉兴奋性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、离子跨膜运输、释放神经传导介质、信使传导等方面起着重要作用。钙的检测包括沉淀法、EDTA鳌合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技术，但容易受到钠、钾、磷酸盐、硫酸盐的干扰，或者受限于仪器的特殊的要求。Fluo-4，一种与钙离子结合，其荧光强度迅速增强100倍的荧光探针，可以敏感测定微量游离钙离子水平。在荧光分光光度仪下，激发波长485nm，散发波长520nm，来定量测定组织细胞的钙浓度。 产品内容 清理液（Reagent A） 60毫升 裂解液（Reagent B） 0毫升 反应液（Reagent C） 6毫升 饱和液（Reagent D） 2毫升 阴性液（Reagent E） 2毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里； 反应液（Reagent C）避免光照；有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于样品操作的容器 15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器DOUNCE匀浆器：用于组织匀化微型台式离心机：用于样品沉淀 培养箱：用于反应物孵育 黑色96孔板：用于样品荧光测定的容器 荧光酶标仪：用于样品荧光分析 实验步骤 样品准备 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定组织重量 （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管 （选择步骤）加入3毫升 清理液（Reagent A）清洗1次 即刻用刀片切碎组织 放进一个预冷的15毫升锥形离心管 加入预冷的1毫升 裂解液 涡旋震荡5秒，充分混匀 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用棒匀化组织（约80下） 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415） 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管 （选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415） 即刻移入到1.5毫升离心管 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用 测定准备 准备好上述制备的待测样品，置于冰槽里备用 设定好荧光酶标仪（22℃）：激发波长485nm，散发波长520nm 三、荧光测定 准备1个黑色96孔板，标记为：样品孔、空白对照孔、最大对照空 移取100微升（20微克蛋白）上述制备的样品到样品孔里 移取100微升 饱和液（Reagent D）到最大对照空里 移取100微升 阴性液（Reagent E）到空白对照空 分别加入100微升 反应液（Reagent C）到所有孔里 轻轻摇动黑色96孔板，混匀 室温下（22℃），孵育30分钟，避免光照 即刻放进荧光酶标仪测读：获得相对荧光单位（relative fluorescence unit；RFU） 计算样品钙离子浓度（注意：不要遗忘乘上稀释倍数） 【（样品RFU－空白对照孔RFU）÷（最大对照空RFU－样品RFU）】X 345 （纳摩尔；解离常数） 注意事项 本产品为20次操作 操作时，须戴手套 避免使用EDTA等处理样品 孵育反应完成后