PCR测定中常见问题分析课件.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * PCR测定中常见问题分析 卫生部临床检验中心 核酸检测过程 * 分析后 采集容器 采集方式 保存运输 不合格样本： 脂血、溶血、样本量不足 样本 分析中 分析前 设备状态 仪器： 日维护 开机自检 准备 试剂配制 核酸扩增 结果分析 结果记录 核酸纯化 检测系统 试剂 设备 质控品 人员操作 核酸检测 结果不准确 问题出在哪？ 试剂耗材的质检 标本的采集与储存 仪器设备清洁维护（仪器设备状态） 人员操作--试剂准备 人员操作--样本的制备--核酸纯化 人员操作--加样 设备状态--扩增、检测 结果分析 报告解释 污染控制 标本的采集与储存 1. 采集的容器 例如：血液样本，采血管规格，抗凝剂种类？ 容器到达实验室时应处于未曾开启状态 2．样本的保存 检测前、检测后 保存容器？ 纯化后DNA的保存 避免反复冻融 仪器设备状态 1. 仪器设备校准 加样器 方式：计量部门、厂家、自校准 扩增仪 方式：厂家 温浴设备、温湿度计 2. 设备状态 清洁维护 试剂的配制 保证反应的均一性，每次试验的扩增反应混和 液应一次配出，并至少多配1人份。 配制时注意：试剂充分复融、混匀，开盖前瞬时离心； 配制后充分混匀，但不可剧烈震荡，分装前瞬时离心。 配制后不宜放置过久，因为PCR/RT-PCR反应液中的酶、引物、底物在低温与室温下均可按较低的效率起反应而消耗部分原料产生非特异的引物二聚体等，造成扩增效率降低，一般的建议是配制完PCR反应液后的0.5—3小时内应及时上机扩增，加模板后应尽快上机 试剂准备、加样 试剂配制的均一性、分装的均一性 常用试剂的分装、储存及使用容器 加样准确性和重复性 加样量 样本的制备----核酸纯化 核酸提取方法 人员操作 仪器设备状态 样本量 样本的制备----核酸纯化 一般原理：均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。 一般步骤：去垢剂裂解--蛋白酶处理-- 有机溶剂提取--乙醇沉淀等步骤。 纯化目的：核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。 1. 核酸提取方法 样本的制备----核酸纯化 纯化质量评价： 抑制物的去除 来自样本--血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸酶等。 来自提取过程--乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂 。 保证措施：对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施；核酸提取及扩增有效性的质控 样本的制备----核酸纯化 2. 人员操作 加样的准确 避免交叉污染 振荡的幅度、时间 温育的温度、时间 …… 样本的制备----核酸纯化 3. 仪器设备状态 离心机 金属浴/水浴 加样器 全自动样本处理系统 样本的制备----核酸纯化 1．纯化的原则 防止和抑制DNase对DNA的降解； 尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏，保持DNA分子的完整； 将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。 2．可能出现的问题 模板中含有杂蛋白质，特别是染色体中的组蛋白 模板中含有Taq酶抑制剂； 在提取制备模板时丢失过多，提取效率低 提出过程中引入的有机溶剂未去除。 样本的制备----核酸纯化 4.样本量 50?l 样本 灵敏度500IU/ml 200?l 样本 灵敏度50IU/ml 扩增、检测 1．加模板（上样） 加入提取好的核酸模板时需格外小心，往往PCR扩增所需加入的模板量只有2μl，加样器的使用显得尤其重要，须控制加样精密度于准确的。 扩增管盖子要盖紧，管盖没有盖好造成PCR反应液热蒸发，影响反应温度的准确控制及反应也各成份的浓度，同时也成为一个污染源。（压盖时由于粗心或者用力不均致使部分盖子变形，也是实验室常见的问题） 扩增、检测 熟悉仪器设备的特点，标本的放置，参数设置…… 扩增、检测 影响因素：引物、探针、仪器设备状态 扩增效率： 关于污染 1．样本的污染 微生物、操作人员、标本之间的交叉污染 2．扩增产物或模板的污染 试剂、加样器、操作台面… PCR产