HPLC的方法开发3.pptVIP

Section 3液相色谱的方法的建立HPLC Method development （一）分离方法 第一步干什么? 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献 仪器制造商的文献，如Waters， Agilent 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己建立方法 充分了解您自己的样品 分析时要了解哪方面的情况？ 灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 分离时要了解哪方面的情况？ 要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成? 选HPLC参数时的基本考虑 溶解度 - 选择流动相的条件 分子量 - 在样品预处理或GPC分析时有用 官能团 - 有否离子化基团? 保留特性如何? 样品的基质 - 考虑如何前处理 在基质中样品的含量 - 分析、制备都需考虑 检测特性 - 有否紫外吸收? 荧光? 找出样品中不同组份之间的差异 摸索条件的重要线索 一般的具体步骤 先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k’ 值改变保留值 调节a值改变选择性 调节柱长度改变柱效及分离速度 使用文献方法 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法中的流动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度） 色谱方法转换 如果没有与文献或要求相近的色谱柱 转换进样量 转换流速 HPLC的方法开发实例 开发过程实例 样品： ① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben) 色谱条件∶ 色谱柱：C18，4mm×30mm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：2ml/min 改变容量因子 K 改变选择性∶a 通过改变流动相改变选择性 同样强度的不同溶剂 改变色谱柱 离子型化合物的分离方式 使用离子交换柱∶离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子 使用反相柱 离子抑制色谱法 通过改变流动相的pH值，使样品成中性 离子对色谱法 加入“对离子”，使样品呈中性 离子抑制色谱 离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 适用于弱酸性化合物的分离 降低流动相的pH值，使样品降低离子化 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内 常用缓冲液及其pH值 离子抑制色谱实例 在乙腈/水及pH=7时，多数保留时间很短，无法完全分离。 离子抑制色谱的使用范围 如果： 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化 可以有以下的选择 离子交换色谱 使用聚合物反相柱，在pH高于7时用离子抑制法 使用“离子对色谱法” 在高pH值下用离子抑制 色谱柱：D18-613(聚合物基质)，室温 流动相：乙腈/0.01M NH4OH + 0.01M TBA 流 速：1.0ml/min 检 测：UV-240nm 样 品：巴比妥的衍生物 ① 巴比妥 ② 己琐巴比妥 ③ 甲基苯巴比妥 ④ 速可巴比妥 离子对色谱法 在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离的组份形成“对离子” 在反相色谱柱上分离离子型化合物 离子对试剂的类型 PIC A：磷酸季丁铵，适用于弱酸 PIC B：烷基磺酸盐，适用于弱碱 烷基长度不同，形成对离子的能力不同 通常有：B5，B6，B7，B8 PIC D4：磷酸二丁胺，适用于弱碱 离子对色谱机理 用离子对？还是离子抑制？ 离子对色谱的应用 使用五烷基磺酸盐 使用六烷基磺酸盐 使用七烷基磺酸盐 样品浓度对分析的影响 离子对色谱分析水溶性维生素 用不同的离子对试剂 离子对色谱 - 水溶性维生素 方法开发的其他因素 流速对柱效的影响 不同内径的色谱柱有自己的最佳流速 样品的进样量(浓度)对柱效的影响 样品的进样体积对柱效的影响 溶剂粘度对柱效的影响 以上因素均影响分离度 结论 充分用已知样品结构确定以哪种方法开始 普通反相? 离子抑制? 离子对? 还是其他 观察流动相条件改变时色谱峰的移动 根据变化的方向及大小决定下一步干什么 改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！ 色谱柱的改变影响最大 液相色谱的方法开发