中国农业科学——利用原位杂交及原位 RT-PCR 技术检测梨树组织中 苹果茎痘病毒的分布.pdfVIP

中国农业科学 2008,41(12):4092-4099 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.12.020 利用原位杂交及原位RT-PCR技术检测梨树组织中 苹果茎痘病毒的分布 赵 英，牛建新 （石河子大学农学院园艺系，新疆石河子 832003 ） 摘要： 【目的】搞清苹果茎痘病毒在梨树组织中的分布，为茎尖脱毒提供直接的理论依据和技术支撑。 【方法】以库尔勒香梨茎尖、叶片为材料，利用非放射性标记物地高辛（DIG），通过 RT-PCR 反应体系，合成 了苹果茎痘病毒的cDNA探针，利用核酸探针斑点杂交检测方法对该探针特异性及灵敏度进行验证。研究制作了适 合原位PCR及原位杂交的石蜡切片，利用原位反转录酶聚合酶链式反应（IS-RT-PCR）技术检测石蜡切片组织中苹 果茎痘病毒RNA的定位及分布，并对影响实验结果的重要因素进行优化。【结果】梨树中的苹果茎痘病毒RNA阳性 信号主要位于叶片的叶肉细胞、茎尖的外围皮层组织及相应的初生维管束。蛋白酶 K消化时间以20 min为宜，要 -1 -1 获得良好的扩增效果，RT 反应体系中RNasin的量需大于0.2 U·µl ，dNTPs大于0.4 mmol·L ，SuperScriptⅡ在 -1 -1 0.1～1.3 U·µl ，引物在 0.9 µmol·L 以上。PCR 反应体系中适宜的退火温度为 60℃，循环 35 次，引物浓度应在 0.8～1.2 µmol·L-1 -1 ，LA Taq 酶浓度大于 0.5 U·100·µl 。【结论】梨树茎尖顶端分生组织 0.25 mm 的区域为无病毒 区域。 关键词：库尔勒香梨；苹果茎痘病毒；cDNA探针；地高辛；原位PCR A Study of the Distribution of Apple Stem Pitting Virus in Tissues of Pear Tree Using in situ Hybridization and in situ RT-PCR ZHAO Ying, NIU Jian-xin (Horticultural Department, Agricultural College of Shihezi University, Shihezi 832003, Xinjiang) Abstract: 【Objective 】To understand the distribution of ASPV in tissues of pear tree and provide direct theoretical and technical support for viruses-elimination of shoot tips. 【Method 】 With shoot pits and leaves of Korla pear trees, labeled by non-radioactivity Digoxigenin (DIG), cDNA probe for ASPV was synthesized through RT-PCR