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植物高光效基因工程研究进展 outline 背景 C3和C4植物 Rubisco 的修饰与改造 C4光合途径中关键酶基因的克隆与转化 植物高光效基因工程面临的挑战  背景 高光效育种是培育高产品种的新途径。一些主要农作物如水稻、小麦、马铃薯、甜菜等均为C3 作物，较低的光合效率成为限制其产量进一步提高的重要内在因素之一。通过提高光合作用效率来增加作物产量一直是国际上光合作用研究和作物遗传育种研究的热点之一。自20 世纪60 年代以来，人们试图通过常规杂交育种手段来改进C3 植物的光合效率，但未取得预期结果。近年来，基因克隆和转基因技术逐步完善，为改善作物光合效率提供了新途径。 C3植物和C4植物 植物的光合产物是人类赖以生存的物质基础。根据光合作用中CO2 的同化途径，植物可分成C3，C4 和CAM三类。 C3 植物通过1，5- 二磷酸 核酮糖羧化酶/ 加氧酶（Rubisco）催化1,5- 二磷酸核酮糖（RuBP）羧化，直接同化大气中的CO2， 产生2 个三碳化合物3- 磷酸甘油酸，该途径称为C3 途径（或卡尔文循环）。Rubisco 还催化加 氧反应，使羧化合成的碳水化合物被氧化，固定的能量重新被释放。Rubisco 催化反应的双重性以及对CO2 的高Km 值是C3 植物低光合效率的主要原因。 C4 植物CO2 的初始固定由位于叶肉细胞的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）所催化，该酶对CO2 的结合能力特别强，催化空气中的CO2 与其受体磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）形成四碳化合物草酰乙酸（OAA），该途径称为C4 途径。在C4 途径中，OAA 经叶绿体中的NADP- 苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）还原为苹果酸（MA），MA 再转运至鞘细胞中脱羧，释放出的CO2 进入C3 循环被Rubisco 固定，而余下的三碳产物（丙酮酸）重新运回叶肉细胞的叶绿体内，在磷酸丙酮酸二激酶（PPDK）催化下形成CO2 受体PEP。C4 循环增加了维管束鞘细胞中CO2 的浓度，同时提高了Rubisco 的羧化活性，抑制了它的加氧活性，使C4植物保持较高的光合效率。 因此，随着生物技术的发展，根据C4碳同化途径的特点，我们利用C4途径关键酶基因改善C3植物的光合效率，进而提高产量成为植物高光效育种的研究热点。 Rubisco 的修饰与改造 Rubisco 广泛分布于具有光合功能的细胞器中。在C3 植物中Rubisco 主要存在于叶肉细胞的叶绿体间质中，在基粒片层上也有少量分布。在C4 植物中，Rubisco 则定位于维管束鞘细胞中的叶绿体间质内。 Rubisco 由多个大亚基和小亚基组成，大亚基具有催化功能，小亚基仅具有调节作用。Rubisco 催化C3 途径的第1 步，即把CO2分子共价结合到底物RuBP （1，5- 二磷酸核酮糖）上，形成3- 磷酸甘油酸。但其羧化反应速度每秒只有2～3 次，与一般的酶促反应速度（每秒25 000 次左右）相比，效率极低。 Rubisco 是一种双功能酶，还催化另外1 个反应（即加氧反应，即Rubisco 不与CO2 结合而是与O2 结合，除消耗能量外，还损失羧化反应中固定的20%～50%的有机碳）。 提高Rubisco 同化CO2 的效率，抑制其加氧功能，无疑会提高作物产量。许多研究者希望通过基因定点突变改变酶的结构，以改变Rubisco羧化/ 加氧的比值，但至今仍未获得成功，突变后的酶活性并未显著提高。 1994 年，Read 和Tabita 发现在硅藻和红藻中存在的Rubisco 具有比高等植物高得多的效率。此后，Uemura 等又发现一种嗜热红藻的Rubisco 羧化效率约是高等植物的2.5～3 倍。在红藻中发现的具有较高效率的Rubisco，为修饰改造Rubisco 提供了依据。 Whitney 等通过质体转化的方法将红藻Rubisco的小亚基编码基因引入烟草的叶绿体中，得到了高效表达，但是表达的小亚基却不能与烟草本身的大亚基组装成全酶。因此，要提高Rubisco 的效率需要进一步了解该酶的蛋白结构与其催化效率之间的关系及其大小亚基组装成全酶的修饰机制。 C4光合途径中关键酶基因的克隆与转化 C4 光合途径中主要涉及3 种关键酶，即磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、磷酸丙酮酸二激酶（PPDK） 和依赖于NADP 的苹果酸酶（NADP-ME）。 PEPC 可分为C4 型、C3 型和根型。C4 型主要负责C4 双羧酸循环途径中固定CO2 的初始反应，C4 光合循环的关键限速酶。将玉米的C4 型PEPC 基因导入水稻，叶片的PEPC