pcr为基础常用检测技术.pptVIP

第四章 PCR为基础的常用检测技术 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 6、RAPD技术 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 PCR技术 相关的PCR为基础的检测技术 防止PCR污染的对策 常见问题的处理 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 一、PCR技术简介 Polymerase chain reaction 1、反应过程 变性 退火 延伸 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 2、反应的优化 （1）模板 一般为102～105拷贝 1μg人基因组——3×105单拷贝——0.2～0.5ng * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 样品中残存血红素对PCR扩增的影响 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 （2）引物 引物的设计原则 长度：Ln = 2×（G+C）+（A+T） G+C含量：40%～60% Tm = 4×（G+C）+2×（A+T） 有效引物Tm为55～80℃ 碱基分布： 自身碱基结构： * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 （3）缓冲液 （4）Mg2+： 0.5～2.5mmol/L （5）dNTP： 20～200μmol/L （6）聚合酶 （7）温度循环参数 （8）PCR促进剂： DMSO、甘油、石蜡油等 （9）忠实性 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 （10）“平台效应”——plateau effect dNTP与引物快速掺入 酶与模板的比例下降 酶活力与dNTP稳定性下降 引物二聚体 产物高浓度时变性不完全 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 二、相关的PCR为基础的检测技术 1、PCR-SSO技术 序列特异性寡核苷酸-聚合酶链式反应 （sequence specific oligonucleotide-PCR） 等位基因特异寡核苷酸-聚合酶链式反应 （allelic specific oligonucleotide-PCR） * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 原理 1986年 Amgelini 利用合成与一种或多种等位基因特异碱基序列的互补寡核苷酸探针，与固定在尼龙膜上的PCR扩增产物进行杂交，检测有碱基序列差异的特定等位基因多态性 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 注意事项 点样量要一致 阳性对照和阴性对照 严格控制杂交温度 严格控制洗膜温度 必须是特异性扩增 探针长度尽可能统一 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 2、SSP-PCR技术 序列特异引物-PCR（sequence specific primer-PCR） 等位基因特异-PCR（allelic specific-PCR，AS-PCR） * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 原理 根据基因座某一碱基的差异设计一系列引物，在确定某一碱基为该等位基因所特有的基础上设计一对引物，两引物3′端的第一个碱基均与等位基因特异碱基互补，特异性引物仅扩增与其相应的等位基因，而不扩增其他的等位基因 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 3、PCR-RFLP技术 （restriction fragment length polymorphism-PCR） 原理 利用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 4、PCR-SSCP技术 单链构象多态性-聚合酶链式反应（single strand conformation polymorphism-PCR） 原理 在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，单链DNA因碱基顺序不同所形成的构象不同，电泳迁移率也不同 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 凝胶浓度对分离结果的影响 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 温度对SSCP的影响 * 第四章 PCR为基础的常用检测技术 SSCP-PCR技术特点 技术简便、灵敏度高 不需要特殊设备 可不用特