湖南师大分子生物学课件sectionGjlz2010.pptVIP

Web 生物谷 螺旋网 美国国立生物信息中心 限制性内切酶的命名 如何使DNA片段定向插入到载体中和避免载体自身环化？ （1）用两种酶进行酶切 （2）用碱性磷酸酶处理载体，该酶可以从DNA分子的5’端除去磷酸. Agrose gel electrophoresis DNA迁移率决定于DNA片段的分子量、构型； 凝胶的分辨率同凝胶的类型和浓度有关。 Isolation of fragments insert Restriction digestion Agarose gel electrophoresis 3. Gel excision and purification Ligation with vector transformation G4. Ligation, transformation and analysis of recombinants G4.1 DNA ligation (DNA连接) Covalently join the DNA molecules with the base-pairing cohesive ends, or blunt ends T4 DNA ligase uses ATP, while. E. coli ligase uses NAD+ Recombinant DNA (重组DNA) DNA片段可以正反两个方向插入载体形成环状分子(即重组分子). 载体也可以自身连接。 G4.2 Transformation and selection Transformation(转化): a process of uptake of exogenous DNA by competent cells. 大肠杆菌（ E. coli ）转化过程： DNA与competent cells(感受态细胞)在冰上混合 ?heat shock（热激）1-2 min?加适量液体培养基培养?涂抹在含抗生素的固体培养基琼脂平板上进行选择 Selection（选择）refers to application of conditions that favors the growth of cells or phages that carry the vector or vector and insert. Transformation rate(转化率)：每微克用于转化的DNA在选择平板上所形成的菌落(colony)数。 Screening(筛选）allows all cells to grow, but tests the resulting clones for the presence of the insert in the vector. 抗性基因的插入失活 蓝白斑筛选 （参见H1） Growth and storage of transformants（转化子） Grow in liquid broth(液体培养基) with antibiotics Store a portion of culture with 15-30% glycerol (甘油) at -20℃ or -70℃ G4.3 Analysis of recombinants Distinguish the recombinant plasmids from the recreated vectors by Size of the plasmids Restriction digestion 2. Determine the orientation of a inserted DNA fragment by double digest 一、名词解释 DNA cloning, subcloning, cohesive ends, recombinant DNA, transformation, transformation efficiency, restriction endonuclease 二、简答题 1.什么是DNA克隆？DNA克隆包括哪些步骤？ 2. 什么是亚克隆?简述亚克隆的步骤。 3. 简述碱裂解法小量制备质粒DNA的步骤。请说明碱裂解液的成分和各成分的作用。 4. 在克隆过程中如何防止载体的自身连接？如何使插入片段定向克隆到载体中？ 课后练习 The end * 分子生物学 Molecular Biolog