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疫苗类生物制品的工艺流程初探 主讲：何小周 一、疫苗类制品概述 　　传染病是引起人和动物死亡的最重要疾病,一直是人们研究和防治的重点。疫苗是在疫病感染之前为了增强机体免疫力而使用的生物制剂。特别是在抗生素对病原体无效的情况下,接种疫苗已经成为防治传染病的主要手段。疫苗免疫接种不是预防动物传染病的唯一方法,但是最有效而实用的方法。 疫苗研制的基本程序： 近年来，人们对可能出现的全球性流感和其他新型疾病的忧虑，使得越来越多的人开始把目光投向疫苗，疫苗被视为全球健康政策中的关键环节。 这种针对特定疾病的快速响应能力需要企业在生产过程中具有一定的工艺灵活性，能够迅速提升产能以应对市场需求。 疫苗的生产制造一般要经历一系列复杂的生物工艺流程，主要包括：发酵、收集、灭活、下游加工、配制和灌装。 步骤1：从细菌壁中生产出一个多糖，并进行纯化处理。 步骤2：生产出载体蛋白（通常为白喉类毒素或破伤风毒素），并进行纯化处理。 步骤3：通过共价键将这两个基团共轭结合，并去除所有那些不需要的副产品如非共轭产品。 二、生产工艺实例 （一）人用禽流感裂解疫苗生产工艺 1、病毒浓缩工艺 超滤膜包选择:选择了截留分子量为300kD的超滤膜进行超滤浓缩。采用的超滤器为Satoro公司产品,膜包面积为0.7m2。 PBS平衡液的选择:对灭活后的大流行流感疫苗病毒收获液用300kD的超滤膜包超滤浓缩20～40倍,需要用平衡盐液体进行处理。 平衡液条件：选用0.01mol/L PBS(pH 712)进行8倍体积的衡滤。 超滤工艺蛋白去除率及抗原收率分析: 采用300kD超滤膜包对三批灭活后的大流行流感疫苗病毒收获液进行浓缩,并采用8倍体积的PBS衡滤,取超滤前和超滤后的样品,以Lowry法检测蛋白含量,血凝试验检测血凝滴度,单向免疫扩散法检测HA含量。 试验结果表明:蛋白去除率分别为96.34%、96.70%、97.15%,HA含量收率分别为72.52%、72110%、79174%。 备注：HA——血凝素，流感病毒主要的中和抗原，可刺激机体产生中和抗体。 2、病毒纯化工艺： 纯化系统及介质的选择:凝胶过滤,Sepharose 4 Fast Flow为层析介质。 凝胶过滤层析条件的选择:凝胶层析系统为Amersham的BPG2002750;凝胶为Sepharose4FF;层析柱凝胶装量为14L,使用的平衡盐溶液为0.01mol/L的PBS(pH 712),流速为150ml/min,样品上样量为700ml,使用280nm监测并收集蛋白峰的结果。 用血凝试验测定血凝滴度,单扩测定抗原含量,Lowy法测定蛋白含量。 三批灭活的大流行性流感疫苗病毒浓缩液经凝胶层析后,蛋白去除率分别是35.24%、25.74%、25.81%,HA含量收率分别为81.08%、90.29%、79.51%。 3、病毒裂解工艺 选择Triton X2100为015%的浓度,室温作用2h作为大流行流感裂解疫苗病毒裂解的条件,病毒裂解完整。 选择Triton X2100为0.5%的浓度,室温作用2h作为大流行流感裂解疫苗病毒裂解的条件,病毒裂解完整。 采用PBS超滤8～10倍体积,用于Triton X2100去除工艺,Triton X2100的去除率在90%以上。 分别采用SDS—PA GE、WB对病毒裂解超滤后的抗原成分进行分析,表明病毒裂解超滤后HA1、HA2等主要抗原成分的存在。 对三批病毒裂解原液进行检定,大流行流感裂解疫苗原液合格。 4、制剂处方和工艺 用生理盐水配制8%的AlCl3和4%的NaO H溶液,AlCl3和NaO H溶液按3∶2的比例混合,高压灭菌,配制为13mg/ml的氢氧化铝。 将氢氧化铝用生理盐水稀释至2.4mg/ml,缓慢加入HA含量为120、60、30μg/ml的疫苗稀释原液中,于20～25℃搅拌吸附4h,配制大流行流感裂解疫苗半成品。 铝佐剂剂量的筛选及用量的确定:固定HA抗原量为30、60μg/ml,铝佐剂吸附后终浓度为0.4、0.8、1.2、1.6mg/ml,通过血凝滴度、抗原含量及免疫Balb/c小鼠检测中和抗体效价,确定Al盐佐剂的最佳用量。 结果表明,在抗原完全吸附的情况下,增加佐剂的剂量并不能增加疫苗的中和抗体效价。 备注： 佐剂：与抗原同时注入体内，可以增强免疫应答。 以上研究确定了大流行流感疫苗的生产工艺,利用该工艺生产的疫苗质量可控,适宜大规模生产。同时确定了大流行流感疫苗临床研究的最佳剂量,为疫苗进入临床研究奠定了很好的基础。 参考文献：张钰、罗德炎等. 人用禽流感疫苗生产工艺的研究.解放军医学杂志.2006,12.31-12 （二）DNA疫苗生产工艺的研究 概述：D NA疫苗生产工艺一般流程 一套完整的质粒DNA大规模制备工