中草药添加对灵芝液态培养生理活性成分生成之影响-东海大学化学.DOC

中草藥添加對靈芝液態培養生理活性成分生成之影響 研究生：方凱平 指導老師：楊芳鏘 摘要--靈芝是中國人自古以來珍貴的要用真菌，靈芝多醣及三萜類化合物，可經由口服來提昇免疫機能，達成間接破壞癌細胞的作用。本研究主要目的在使用中草藥內含有的有效成分來進行靈芝的液態培養，並尋找適當的中草藥種類以及最適當的添加量。由結果顯示，添加花椒濃縮液和薑黃濃縮液的效果較好。在菌重方面，花椒濃縮液培養十五天達到8.19 g/L，為對照組的1.20倍；多醣方面，花椒濃縮液培養第六天達到3.2 g/L，為對照組的1.6倍；靈芝酸方面，薑黃濃縮液培養在第十五天達到14.33 (mg/g D.W.)，為對照組的2.67倍；總多酚方面，薑黃濃縮液培養在第六天達到56.32(mg/g D.W.)，為對照組的2.74倍；類黃酮方面，在第十二天達到4.59(mg/g D.W.) ，為對照組的3.08倍。希望研究結果可供日後靈芝生理活性成分產量提升之參考。 關鍵字:靈芝、中草藥、三萜類 一、緒論 1-1 前言 自古以來，靈芝為珍貴的食藥用真菌，其主要原因是靈芝含有多種具有生物活性與療效的物質，如多醣體、三萜類、超氧歧化酶、生物鹼以及蛋白質等。許多藥物學方面的研究顯示出，靈芝多樣的萃取物具有保肝、降血脂、降血壓、提升免疫系統、抗過氧化和抗癌的功能，用治咳嗽、支氣管炎、關節炎等(林，1990)。 1-2 研究動機 萜類、多醣、及類黃酮具有多種生物活性，抗癌性、抗發炎效應、抗腫瘤活性。由於靈芝子實體的培養一般 , 需要2~3個月polysaccharides）及小分子的三萜類化合物（triterpenoids）和固醇類(steroids)為主。 2-1-2 多醣體（polysaccharides） 多醣體在許多藥用菇類的研究上一直是一個很重要的主題，現已有許多研究發現菇類純化的多醣體具有抗腫瘤作用，且均具有β-D-葡-D-葡聚triterpenoids） 萜類(Terpene)化合物是由碳氫化合物或脂質代謝而產生，以異戊二烯為單體之化合物，分子組成通式(C5H8)n。普遍存在於植物界的一類化合物，在動物界為數甚少，萜類的主要分類法是根據分子中包含異戊二烯單體數目分類，將含有兩個異戊二烯叫做單萜(monoterpene)；含有三個異戊二烯單體叫做倍半萜(sesquiterpene)；含有四個異戊二烯單體叫做雙萜(dieterpene)；含有五個異戊二烯單體叫做二倍半萜(sesterpene)；而含有六個異戊二烯單體則叫做三萜(triterpene)(肖崇厚, 1989)。 2-2 中草藥介紹 選用的五種中草藥，有八角、黃耆、薑黃、花椒、肉桂，八角含有豐富的莽草酸(shikimic acid)，薑黃含有豐富的類黃酮(Flavonoids)黃耆含有豐富的多醣(polysaccharides)，花椒和肉桂含有豐富的單萜類(monoterpenes)，我們期望得到的產物是三萜(triterpenes)，我們試圖增加莽草酸(shikimic acid)、類黃酮(Flavonoids)、多醣(polysaccharides)、單萜類(monoterpenes)的濃度，期望反應能往三萜的方向進行，進而提高三萜的含量三材料與方法3-1 實驗菌株 本實驗所採用之菌株為靈芝屬之赤靈芝Ganoderma lucidum (BCRC36123)，係購自新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，菌株以生物資源中心所建議之PDA做為斜面培養基，接菌完畢後於30℃培養箱生長，之後置於4℃冰箱中保存備用，每2個月更新一次。 3-2水萃液製備 將秤重50 g的基質(八角、黃耆、薑黃、花椒、肉桂)加入1 L的水，煮沸3個小時，用100 mesh篩網過濾後，以真空濃縮器於60℃下減壓濃縮為10倍之中草藥水萃液，取出濃縮液於4℃冷藏備用。 3-3 三角瓶液態培養試驗 此試驗之主要目的，為探討不同培養天數，及添加中草藥水萃液對靈芝有效成分生成之影響。培養條件為，使用250 ml三角瓶，其總操作體積為100 ml，培養溫度為30℃。試驗方法，配置98 ml液態培養基，並利用0.1 N HCl 和0.1 N NaOH，將液態培養基之pH調整為4，倒入250 ml三角瓶中，添加中草藥水萃液2 ml，使總體積達到100 ml，用矽膠塞將錐形瓶口塞緊，至直立式滅菌釜在120℃滅菌20分鐘後，放置於無菌操作台，冷卻至室溫。之後，把三角瓶前培養的種菌，利用滅過菌的均質機(polytron)攪碎菌絲球10秒後，取5 ml的接菌量接種於250 ml三角瓶中，於100 rpm、30℃迴轉式恆溫培養箱中培養，記錄pH、菌體濃度、葡萄糖濃度。 3-4 濃度變化實驗 添加花椒濃縮液於第12天時，菌