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TRIzol提取RNA和DNA简要中文说明 内容来自于invitrogen的15596-026的说明书翻译改动而来NA的分离 准备试剂：TRIzol氯仿100%异丙醇%乙醇无RNase的水handy pestle 操作步骤：RNA操作在冰上进行1、每50～100mg组织加入1ml TRIzol ，handy pestle匀浆RNALater保存的组织，（其实组织50mg提出的RNA大大富余） 2、将匀浆样品在室温（15～30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。 3、每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，用手剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。 5、4℃12,000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的约50%。 6、用200ul的枪2枪把水相转移到新管中（样本足够因此少抽以防止DNA污染）。 7、1mlTRIzol加入0.5ml100%异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。 8、4℃12,000×g离心10分钟，移去上清，之后可以看到RNA沉淀。 9、1ml TRIzol至少加1ml 80%乙醇。（-20°放一年） 10、vortex混匀，4℃下7500×g离心5分钟，弃上清，也可见沉淀。 11、室温放置干燥RNA沉淀，大约5～10分钟即可.加入无RNase的水（乳腺癌100mg样本加50ul浓度大约为2ug/ul），用枪头吸打几次，稍微离心，55～60℃放置10分钟使RNA溶解。可-80℃保存一段时间，最好马上逆转录。 12、260比280是1.8-2.1（低可能是污染，也可能测时候的问题）产量公式：260×稀释倍数×40=ug/ml DNA的分离准备试剂：乙醇0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇） 75%乙醇8mM NaOH 操作步骤： 样品加氯仿分层后，移去上层水相， 1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，颠倒混匀，室温放置3分钟 4℃2000×g离心5分钟。 去上清，用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟， 4℃2000×g离心5分钟，弃上清 （大于200ug的DNA重复一次1-3步骤）。 1ml TRIzol加入1.～2 ml75%乙醇，室温放置10～20分钟不时颠倒混合4℃2000×g离心5分钟， 弃上清。 室温放置晾干DNA 5～15分钟，用8mM NaOH 300l8mMNaOH溶解从1mg组织可能1-4ugDNA。溶解DNA后可用HEPES调节pH。 、DNA中可能包含一些胶状不溶物可>1000×g离心10分钟除去。 将溶液放入新管中。注意事项： 　　预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为： 　　肝和脾6～10μg ，肾3～4μg ，骨骼肌和脑组织1～1.5μg ，胎盘1～4μg ，上皮细胞8～15μg ，成纤维细胞5～7μg 。DNA的定量：取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人、大鼠、小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg，6.5μg，5.8μg。 预期产量：1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3～4μg 骨骼肌，脑组织，胎盘2～3μg 人，大鼠，小鼠培养细胞（1×106）5～7μg 成纤维细胞5～7μg。 应用：　　1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4，取0.1～1μg DNA用作模板。 　　2.酶切反应用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每μg DNA使用3～5单位的酶，80～90%的DNA是可消化的。 　　1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节　　Final pH 0.1M HEPES（μl） Final pH 1M HEPES（μl） 　　8.4 86 7.2 23 　　8.2 93 7.0 32 　　8.0 101 　　7.8 117 　　7.5 159 注意事项： 　　1. DNA在中间层和有机相中时可在2～8保存过夜。 　　2.DNA沉淀在75%乙醇中2～8可保存几个月。 　　3.DNA在8mM NaOH溶液中4可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7～8并且加EDTA至1mM，可置于4或-20长期保存。常见问题分析： 得率低：　　A.样品匀浆和裂解的不彻底。　　B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解。 A260/A280<1.70 ：　　A. 检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。　　B.酚除去的不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。 DNA降