基因工程操作程序2 生物制药工艺学.pptVIP

基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作流程构架 获取目的基因 从基因文库中获取 利用PCR技术扩增 利用化学方法人工合成 原核细胞的基因结构 原核细胞基因 编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质 非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等 原核细胞的基因结构 RNA聚合酶的作用是催化DNA转录为RNA。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。 真核细胞的基因结构 与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是： 编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。 其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子，一般不能够编码蛋白质的序列叫做内含子。 真核细胞的基因结构 真核细胞基因 编码区 （间隔、不连续） 外显子：能编码蛋白质的DNA序列 内含子：不能编码蛋白质的DNA序列 非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 连续的 编码区是间隔的、不连续的 相同点 都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的 基因的种类 （1）编码蛋白质的基因：包括结构基因和调节基因。 （2）没有转译产物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。 （3）不能转录的DNA片段：如操纵基因。 基因组文库和部分基因文库 基因组文库 部分基因文库 cDNA合成过程 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。 第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。 利用PCR技术扩增目的基因 原理: DNA双链复制 前提: 要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。 构建表达载体 表达载体的组成 目的基因 启动子 终止子 标记基因 启动子与终止子 启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能引导RNA聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。 终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。 基因工程载体的构建需要考虑哪些因素 （1）要选择强启动子或组织特异性启动子。启 动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。 （2）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。 转化:目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 将目的基因导入受体细胞 受体细胞种类 方法 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 农杆菌转化法（双子叶植物、裸子植物） 基因枪法（单子叶植物） 花粉管通道法 显微注射技术：目的基因表达载体提纯→ 取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→新性状动物 用Ca2+处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 将目的基因导入受体细胞（植物细胞） 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 思考：根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做? ①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物； ②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 将目的基因导入受体细胞（动物细胞） 显微注射法：此方法的受体细胞多是受精卵。 将目的基因导入受体细胞（微生物细胞） Ca2+处理：先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 四、目的基因的检测与鉴定 1、检测与鉴定的目的 目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持 和表达其遗传特性 检测