《干细胞生物学与疾病治疗》天津医科大讲义,作者-李怡璇.ppt

Lawrence M. Hinman University of San Diego * 干细胞体外培养 胚胎干细胞体外培养的条件： 质量良好的囊胚 有效的内细胞团分离 可靠稳定的培养系统 有效稳定的传代 人类胚胎干细胞体外培养方法 与饲养细胞（feeder cells）共培养法 饲养层细胞是共同培养中用来维持多潜能干细胞未分化特性的细胞，通常指胎鼠的成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF)。一旦脱离饲养层干细胞就自发地进行分化。 无饲养细胞培养法 与饲养细胞共培养法 细胞培养： 细胞传代： /research/NIHresearch/scunit/culture.asp 无饲养细胞培养法 Feeder-free culture mediem： 用含有小鼠胚胎纤维原细胞（MEFs）的代谢产物的hESC medium 在hESC medium中加入促进hESC增殖，但抑制hESC分化的因子或化合物 /research/nihresearch/scunit/feederfree.htm PB为外周血；BM为骨髓；CB为脐带；FL为胎肝；PMVEC为猪微血管内皮细胞支持；ND为未检测到。 体外扩增人造血干/祖细胞 Hum Reprod Update. 2007; 13(2):103-20. HFF 人包皮成纤维细胞 MEFs 小鼠胚胎纤维原细胞 M 机械法 C-IV IV型胶原酶 TE 胰酶/EDTA SKY 多色频谱分析 CGH 比较基因组杂交 FISH 荧光原位杂交 ND 不确定 干细胞大规模培养 细胞体外培养条件： 所有与细胞接触的设备、器材、溶液等都必须保持绝对无菌 必须有充足的营养供应，不能含有有害物质 保证有适应的氧气供应 及时清除细胞代谢产生的有害物质 有良好的适于细胞生存的外界环境，包括渗透压、离子浓度、PH等 及时转种，保持合适的细胞密度 干细胞大规模培养-Bioreactor 微调瓶(Spinner Flask) 旋转壁式(Rotating Wall Vessel) 纳米纤维架(nanofiber scaffolds) Curr Opin Chem Biol. 2007; 11(4): 394–398. Directed differentiation of mouse embryonic stem cells. 干细胞定向诱导分化 干细胞自发分化 干细胞定向诱导分化 胚体（embryoid body, EB）—在体外培养环境中，如果在胚胎干细胞的培养体系中撤除抑制细胞分化的因子（如饲养细胞或白血病抑制因子LIF等），胚胎干细胞就会失去保持未分化状态的能力，可以自发形成多细胞结构，即胚体。胚体中含有3个胚层的细胞，胚体继续分化，可以自发分化为血细胞、内皮细胞及神经细胞等不同类型的细胞。 体外培养（明胶基质）的小鼠胚胎干细胞形成的胚体（×200） Biochemistry (Mosc). 2008; 73(13):1438-52. 干细胞自发分化 人类胚胎干细胞的自发分化 (A)当人类胚胎干细胞移植到免疫缺陷小鼠的睾丸囊内，免疫组化HE染色显示为典型的畸胎瘤：（1）软骨，（2）原始神经细胞，（3）复层扁平上皮，（4）腺上皮，（5）肌肉，及其他细胞。(B)免疫组化显示人类胚胎干细胞的胚体。（Scale bars: A, 800 μM; B, 100 μM） Development 131, 5515-5525 (2004) 干细胞定向诱导分化 干细胞定向诱导分化 加入生长和分化因子（激活内源性转录因子） 干细胞遗传改造（转染外源性转录因子） 与特定分化细胞（饲养细胞）共培养 J Cell Biochem. 2008; 105(3): 633–640. 体外诱导hESC向神经细胞分化 生长和分化因子 悬浮培养法 附着培养法 bFGF Nature Immunology ?5, 359 - 360 (2004) 利用OP9 和OP9-DL1细胞作为基质细胞在体外诱导胚胎干细胞分化为T和B淋巴细胞 共培养法 胚胎干细胞的诱导分化 NR, 未报到; BMP,骨形成蛋白; GFs, 生长因子; EGF,表皮生长因子; VEGF,血管内皮生长因子; GDNF,胶质细胞源性神经营养因子; SCF,干细胞因子; GCSF,粒细胞干细胞因子; EB, 胚体; END-2,内脏内胚层样细胞系. Endocrine Reviews 2006; 27(2):208–219 干细胞的检测方法 根据细胞形态检测：如体积小、核浆比大 根据生长特性检测：呈克隆状生长；ES细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的