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基因工程复习资料 一．基因工程：在体外对不同生物的遗传物质进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（质粒、病毒、噬菌体DNA）插入微生物、植物、动物细胞内进行无性繁殖、并表达出基因产物。 二． 一）1.同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。 同裂酶的类型： 1)同序同切酶：识别位点和切点完全相同。如Hind Ⅲ 和Hsu I。 2)同序异切酶：识别位点相同，但切点不同。如Kpn I 和 Acc65 I。 3)同功多位酶：许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。 4）其他：有些限制酶识别的序列交叉。 2 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等。同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。 3. 限制性内切酶的命名： 1）用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。 2. ）用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。 3） 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I。 EcoR I: E, 属名的第一个字母; co种名的头两个字母;R, 菌株或型号; I,序号；Eco为斜体，R为正体。 4.限制性内切酶产生的末端： 1）产生匹配黏端：即黏性末端，识别位点为回文对称结构的序列经限制性内切酶切割后产生的末端。 2）产生平末端：回文对称轴上同时切割DNA的两条链。 3）产生非对称突出末端：识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物末端是不同的。 5、 常用的DNA聚合酶的： 1.） 共同特点：把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。 2. ）主要区别： （1）持续合成能力和外切酶活性不同。 （2）T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。 （3）其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。 5、星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为星星活性。 抑制星星活性的措施：减少酶的用量，减少甘油浓度，保证反应体系中无有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100~150mmol/L和降低反应PH到7.0以及保证使用Mg2+作为2价阳离子。 6、位点偏爱：某些限制酶对同一底物中的有位点表现出偏爱性切割，即对不同位点的同一个识别序列表现出不同的切割效率。 二）▲1、大肠杆菌DNA聚合酶 I：主要用来制备带放射性标记的DNA探针。 （1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质： ①一条单链多肽。 ②5’(3’外切酶活性位于N端。 ③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’(3’外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。 （2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件： ① 底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） ② Mg2+ ③ 带有3’—OH游离端的引物 ④ DNA模板 （3）主要用途： 1）3’端补平：补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。 2）DNA 3’末端标记：在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。 3）用于cDNA克隆的第二链的合成 4）利用5’ (3’外切核酸酶活性，可以切口平移法，标记DNA，所有DNA聚合酶中只有些酶有此反应。 2.、Klenow DNA聚合酶：具有5’(3’聚合酶活性和3’(5’外切酶活性。（失去了5’(3’外切酶活性）。 用途：① 3’端补平；② DNA 3’末端标记；③ cDNA第二链的合成。 3.、1）T4 DNA聚合酶：有5’(3’聚合酶活性和3’(5’外切酶活性（降解单链更快）。当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’(5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。 2）T4 DNA聚合酶用途：① 补平隐蔽末端；② DNA 3’末端标记。 3）标记末端（取代合成法）：用3’(5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。再利用它的5’(3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。 4、1） T7 DNA聚合酶的特点： ① 持续合成能力强； ③ 不受DNA二级结构的影响。 ② 3’(5’外切酶活性高，单链和双链都能降解。； 2）T7 DNA聚合酶用途：① 以大分子量DNA为模板的合成；② 进行末端标记 ；③ 补平隐蔽末端。 5、耐热DNA聚合酶：在高温下具有活性的DNA聚合酶，主要用了PCR. 6、DNA 连接酶类型： 1）大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端。2）T4 DNA连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接齐平