DEAEsehase　FF说明书准确翻译版.docx

离子交换柱 说明书翻译目录简介所需材料处理填料组装柱子填料装柱平衡样品处理操作流速吸附洗脱再生在位清洗（CIP）清洁保存附录A附录B附录C订货须知简介CM Sepharose Fast Flow, DEAE Sepharose Fast Flow, Q Sepharose Fast Flow和SP Sepharose Fast Flow这些都是离子交换色谱的填料，高效且具有优良的流动性能。以下说明以在推荐柱子XK 16/20中填充填料为例，不同尺寸的柱子请参考“附录A”修改填柱方案。Sepharose FF填料也可以装在Tricorn高性能层析柱中。请阅读并遵循装柱指示手册。技巧详情请翻阅Ion Exchange Chromatography and Chromatofocusing: Principles and Methods所需材料填料、柱子、泵、梯度混合器、进样阀、量筒、烧杯、真空瓶、注射器、玻璃棒、缓冲液填料缓冲液应与初始缓冲液相同，缓冲液推荐见附录C中的表2和表3。装柱时应避免使用高粘度的缓冲液，若使用，则需降低流速。处理填料所有材料至室温倾倒填料，洗掉存储液，替换为缓冲液，配成的匀浆总体积为32.5ml（75%的填料，25%的缓冲液）注意：Sepharose Fast Flow离交柱CM, DEAE 和 Q存储在20%的酒精中，SP Sepharose Fast Flow存储在20%的乙醇和0.2M的醋酸钠中给匀浆脱气组装柱子装柱前确保每个组件完好无损，特别是网柱底连接注射器或者泵柱底浸没在缓冲液，用泵或注射器将缓冲液润洗整柱体，确保装柱无气泡塞上出口， 装上柱底用缓冲液冲洗柱子，使柱底保持一小段液位，并保持柱垂直 填料装柱以下说明以XK 16/20柱为例，不同尺寸的柱子请参考“附录A”。用玻璃棒引导沿着柱壁连续倒入匀浆，勿使产生气泡，柱子的剩余部分填充缓冲液。通过没入缓冲液浸湿柱塞端的接合器，使用泵或注射器牵引缓冲液，确保无气泡停止泵从顶端以一个合适的角度插入适配器，注意网下不要有空气。拧紧适配器的橡胶塞，密封柱子给进样阀配一个合适的软管，连接适配器和泵通过进样管滑动适配器插入柱中，以此排掉管内所有空气继续插入适配器直至胶浆，拧紧橡皮圈，锁定适配器的位置打开柱子的底部出口，启动泵，以12到14ml/min的速度冲洗柱子，保持速度直至柱床高度不变（一般4到5min）注意：Fast Flow填料在理想情况下受压不变，如16mm直径的柱子受压为0.2 MPa (2 bar)停泵，关闭出口阀，放松橡皮阀，重新将适配器滑动定位于凝胶床表面上方适配器插入凝胶1到2mm，开阀开泵，流速如上若需继续冲压凝胶床，重复步骤5，凝胶床稳定后，平衡后柱子即可使用，若有需要，参考附录B检验柱子是否合格平衡用泵将100ml的初始缓冲液以流速8-10ml/min平衡柱子，pH与导电性与初始缓冲液一致时平衡结束样品处理上样量取决于柱子离子交换的能力和容量。一般不要超出容量的10%到20%，相关指导见附录C的表1。样品用初始缓冲液溶解，样品粘度不要超过缓冲液，对于正常的水系缓冲系统，粘度应与50 mg/ml的蛋白浓缩液一致上样前，样液应离心或过0.45um的过滤器除去颗粒物操作流速上样与后来洗脱的流速有具体的标准，但通常在10-15ml/min之间，速度越小分离效果越好。吸附离子交换的常规程序是结合目标产品，同时允许非目标物质通过柱子。但有时候，也可以结合非目标物质使目标产品通过。为了更有效率的吸附结合物质，初始缓冲液的离子强度必须很弱，pH应至少与目标产品的等电点相差一个pH单位，选定的盐缓冲液pH波动在0.5以内。注意：DEAE Sepharose Fast Flow的初始缓冲液建议pH高出目标产品等电点一个单位。不同pH缓冲液的建议见附录C的表2和表3洗脱线性增加NaCl的浓度是离子交换中洗脱最常用的方法，建议梯度从无NaCl的初始缓冲液开始，到含0.5M的初始缓冲液为止，至少洗脱400ml，若此梯度内无法洗脱样品则增高盐浓度。线性变换pH的方法见Ion Exchange Chromatography and Chromatofocusing, Principles and Methods（不使用）再生再生一般使用高离子交换能力的缓冲液冲柱（如含1到2M NaCl的初始缓冲液）或变换pH，再生流速为8到10ml/min，再生时监控紫外吸收以保证无残留。若有变性蛋白或脂肪残留，则需进行CIP在位清洗（CIP）(暂时不需要)清洁清洁使微生物造成的污染降到最低使用0.5 到 1 M 的NaOH反向冲洗柱子，流速1.2 到 1.4 ml/min，重新用无菌的100 ml初始缓冲液平衡柱子保存DEAE Sepharose Fast Flow填料可