色谱技术幻灯片.pptVIP

§6羟基磷灰石色谱 吸附介质：羟基磷灰石(hydroxyapatite Ca10(PO4)6(OH)2） 纯化蛋白质的无机介质。 廉价，易于大规模应用， 使用后易于清洁 吸附机理与规律：基于钙离子和磷酸根离子的静电引力进行分离 ◆电性作用是它吸附蛋白质的重要原因 羟基磷灰石(HydroxyIapatite，简称HAP) 是一种结晶状无机盐，属六方晶系，存在于自然界中 与生物体有很好的相容性，也是目前分离各类生物分子最常用的液相色谱介质之一．在分离过程中，待分离分子以多种方式吸附于HAP晶体表面，即分子以不同的局部面向HAP晶体表面，并以不同方向排列．根据统计力学定律，在这些不同的吸附配置之间遵从Boltzmann分布，且能量最稳定状态配置的几率最高，酸性分子(pI＜7)主要吸附于c位点，碱性分子(pI7)主要吸附于P位点 ．由于HAP晶面具有规则的立体化学结构，可以分辨被吸附分子表面上原子几何排列的微小差别． HAP，价格低廉，特殊的吸附机理，适用于大规模分离过程，在DNA、核苷酸、多肽以及多种蛋白质的分离中得到广泛的应用，是单克隆抗体的主要纯化手段 蛋白质纯化的策略 蛋白质纯化原则 明确目标-纯度、活性、产量 明确目标蛋白和关键杂质的理化特性 发展确定适宜的检测分析技术 尽可能少得使用添加剂 尽早除去对目标产物有害的杂质 使用的纯化步骤尽可能少 三步纯化策略 三步纯化中各纯化技术的逻辑组合 Technique Ppt HIC AIEX CIEX AC Purificationfactor 7 20 2408 18647 Porcine cerebella homogenate RESOURCE Q Ammonium sulfateprecipitation Butyl Sepharose Fast Flow RESOURCE s HiTrap Heparin G Protein Receptor Kinase Purification Rec a-Mannosidase Purification from Pichia Technique Purificationfactor 63 622 719 UF GF AIEX HIC Phenyl Sepharose HP Q Sepharose FF Superdex 200 pg Ultrafiltration 作业 在Web of science 检索1篇关于蛋白质分离纯化的文献。 依据文献写出其蛋白质纯化的工艺路线，并进行合理的讨论、分析。 英文文献首页、方法页打印和你的作业装订后，于16周周五交。 §3离子交换色谱Ion exchange chromatography 基本原理 离子交换色谱（Ion exchange chromatography IEC）:利用离子交换剂为固定相，依据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。 Kd=A/IB+Kd∞ 离子强度（ionic strength）I等于溶液中每种离子i的质量摩尔浓度（mi）乘以该离子的价数（zi）的平方所得诸项之和的一半 对于特定的物质，A、B为常数， Kd仅与流动相的离子强度有关 不同的物质，其A、B不同，其在固定相和流动相的分配也就不同 对于两性电解质（蛋白质），A和B为PH值的函数。 B为溶质的静电荷数与离子交换基的离子价数之比。蛋白质等生物大分子为多价电解质，在PH偏离等电点的溶液中静电荷数常为两位数以上，故B值比较大。 一方面，蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感，离子强度的微小改变，就会引起分配系数的很大变化；另一方面不同蛋白质的B值可能相差很大。 一般进行梯度洗脱 基本原理 基本原理 球形阴离子交换剂 阴离子交换：固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂。阴离子交换基有DEAE（二乙胺乙基，适用范围PH8.6）和Q（季铵乙基）。 基本原理 接枝阳离子交换剂 阳离子交换：固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阳离子交换基为CM（羧甲基）和SP（磺丙基）。 分离过程 分离过程 洗脱方式 Kd=A/IB+Kd∞ 线性梯度洗脱 优点：流动相离子强度连续增大，不出现干扰峰，操作范围广 缺点： 需要特殊的调配浓度梯度的设备 洗脱方式 逐次洗脱 优点：利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，不需要特殊梯度设备，操作简单 缺点 ：流动相不连续变化，容易出现干扰峰，洗脱操作参数的确定是分离的难点和关键 离子交换色谱的应用 任何荷电物质的分离纯化 纯水的制备 蛋