质粒提取及双酶切鉴定内切酶内切重组质粒.pptVIP

基因载体（gene vector） ＊什么是基因载体 把一个有用的目的DNA片断通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具 ＊基因载体的作用 ※为目的基因提供进入受体细胞的转移能力 ※为目的基因提供在受体细胞中的复制（或整 合）和表达 所需条件 基因载体应具备特点: ★ 具有独立复制能力，在细胞中能大量繁殖，从而使目的基因大量扩增 ★ 具有适当的限制性内切酶识别和切割位点 ★ 具有供筛选用的遗传标记 EcoRⅠ、HindⅢ切割重组质粒 双酶切体系： ddH2O 6μl 质粒DNA 10μl 10×M buffer 2μl EcoRⅠ 1μl HindⅢ 1μl 三、DNA琼脂糖凝胶电泳 原理 在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。 实验步骤： 1、胶带封制胶板两端（示教）； 2、放好梳子，等胶稍稍冷却后灌胶； 3、待胶凝固后撕去胶带，将制胶板放在电泳槽中，轻轻拔掉梳子； 4、加样（10μl质粒和2μl loading buffer在胶带上混匀）； 5、接通电源，开始电泳（120V）; 6、蓝色条带快到终点时停止电泳，EB染色5min； 7、漂洗后紫外灯下观察结果。 注意： 1、灌胶时应避免出现气泡； 2、拔梳子时动作要轻柔，注意不要将胶拔碎； 3、加样时动作要果断而轻柔； 4、EB具有致癌作用，染色时戴手套； 2、观察完毕之后凝胶扔到垃圾桶中； * 分子医学技能 张 彦 TEL: Department of biochemistry molecular biology 质粒DNA的制备、鉴定 内切酶切割重组质粒 （p70、p81） ?? 一、概述 什么是质粒（plasmid） 质粒是存在于细菌体内的一类独立于染色体的可以自主复制的双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。 ? 质粒DNA的一般特性： ①质粒是细菌内的共生型遗传因子有相对独立性。 ②它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型。 ③是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。 质粒DNA与宿主菌染色体DNA的两点不同： ★ 宿主菌染色体(chromosome)DNA通常比质粒DNA要大得多。 ★ 纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒DNA呈闭合环的形式。 ? 提取质粒DNA的目的与意义 ★ 是基因克隆(gene clone)的第一步（分离得到转运目的基因的载体）； ★ 为基因重组(gene recombination)作准备； ★ 质粒可以直接转化(transform)细胞； ★ 为目的基因(target gene)的表达提供条件。 ★ 作为表达载体应能利用宿主的酶系统，表达目的基因 ★ 相对分子量小 ★ 细胞内稳定性高 ★ 可转移性 基因载体类型 ★ 质粒，噬菌体(phage)，病毒(virus)DNA 二、质粒DNA提取原理与方法 核酸分离纯化的总原则： ?保证核酸一级结构(primary structure)完整 ?排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、外源DNA、RNA等） ? 分离纯化质粒DNA的方法有很多种： 碱裂解法、煮沸法、high pure plasmid isolation kit等。各种方法原理相似，都是利用两种DNA的差异来分离的，因此它们有共同的步骤： ①? 培养细菌使质粒扩增 ②? 细菌的收集与裂解 收集——菌