干旱和盐度对植物体内游离脯氨酸积累的影响.docVIP

实验四 干旱和盐度对植物体内游离脯氨酸积累的影响 一、目的 学习测定植物体内脯氨酸含量的方法，并了解植物体内游离脯氨酸的积累与植物抗逆性的关系。 二、原理 胁迫条件下植物体内脯氨酸大量积累，而且胁迫时间越长,积累的脯氨酸越多；因此植物体内的脯氨酸含量在一定程度上反映了植物受胁迫影响的程度，可作为植物对逆境响应的一个参考指标。 在酸性条件下，茚三酮和脯氨酸反应，生成红色化合物，此产物在520nm波长下具有最大吸收峰，可用分光光度计测定，此法具有专一性。在pH1-7时用人造沸石可以除去一些干扰的氨基酸。 三、器材与试剂 植物材料：小麦种子 仪器：天平，研钵，移液管，水浴锅，离心机，试管，分光光度计离心管吸耳球试管架烧杯 试剂：100mmol/L和200mmol/L氯化钠溶液；80%乙醇；人造沸石；活性炭；甲苯或甲苯；冰醋酸；20ug/ml脯氨酸溶液 酸性茚三酮试剂（25g茚三酮溶于60ml冰醋酸和40ml6mol/L磷酸中,加热（70℃）溶解。常温保存期24h，冰箱中保存48h），标准脯氨酸溶液（10mg脯氨酸溶于100ml80％乙醇中，浓度为100ug/ml） 四、实验步骤 （一）制作标准曲线 100ug/ml脯氨酸配置成0、0.5、1.0、5、10、20μg/ml一系列浓度的标准溶液。取标准溶液各2ml，加入2ml３%磺基水杨酸、１ml冰醋酸和３ml茚三酮试剂于加塞试管中，充分混匀后在沸水浴中加热显色40min，冷却后加入４ml甲苯盖好盖子充分震荡，待其静置分层后，吸取红色甲苯相，于波长520nm测定OD值，以OD值为纵坐标，脯氨酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线。 （二）NaCl胁迫对小麦脯氨酸含量的影响 分别取对照和NaCl处理的小麦幼苗的地上部分（芽鞘和叶子）0.3g，用3%磺基水杨酸5ml研磨提取，匀浆移至试管中，在沸水浴中提取10分钟，加入0.5g人造沸石充分震荡，冷却后转移至离心管中，3000r/min离心10min，取上清液待测。 各取对照和ＮaCl处理的提取上清液2ml，分别加入2ml蒸馏水，１ml冰醋酸和3ml2.5%酸性茚三酮试剂，与上述制作标准曲线一样进行显色，萃取和比色，最后从标准曲线中查得脯氨酸含量。按照公式计算,植物体内脯氨酸含量（ug/g）=4A×2.5/0.3,其中Ａ为查表所得的脯氨酸。 （三）水分胁迫对小麦脯氨酸含量的影响 按照上述测定小麦幼苗中游离脯氨酸的含量程序，测定不同供水处理的小麦幼苗中游离脯氨酸的含量。 五、实验结果分析 1.标准曲线制作的数据 脯氨酸的体积ml 0 0.5 1 1.5 2 2.5 脯氨酸浓度ug/ml 0 1.33 2.66 3.99 5.32 6.65 吸光度1 0 0.129 0.37 0.406 0.716 0.796 吸光度2 0 0.131 0.375 0.402 0.718 0.794 吸光度3 0 0.127 0.368 0.404 0.714 0.79 平均吸光度 0 0.129 0.371 0.404 0.716 0.793 2. 氯化钠对小麦幼苗内游离脯氨酸积累的影响 吸光度 游离脯氨酸浓度ug/ml 每克小麦幼苗中游离脯氨酸的浓度ug/ml 正常处理 0.136 1.883 0.00645 干旱处理 0.302 2.892 0.02079 0.2mol/l Nacl处理 0.166 2.065 0.01485 （根据标准曲线方程求游离脯氨酸浓度） 正常处理小麦幼苗的干重：0.1370g 经干旱处理的小麦幼苗的干重：0.1391g 0.2mol/l Nacl处理的小麦幼苗的干重：0.1391 说明：本组做的是干旱的小麦幼苗；两组由于有植株个体差异，生长环境差异，研磨和提取过程以及所用试剂的差异，没有太大的可比性，但从两个组可以看出，盐胁迫会使植物体内脯氨酸的含量升高，具体的作用不太清楚，很可能是脯氨酸通过参与植物渗透势的调节来抗盐胁迫。 六、误差分析 1.材料研磨得不够仔细，使得组织中脯氨酸提取得不完全。 2.离心后没有对离心的残渣进行再提取，会有部分损伤。 3.制作标准曲线用的是蒸馏水来稀释标准液，虽然同样可以有结果，但应该和用酒精稀释有一定差异。 4.沸水浴的温度一直也达不到，所以反应不够充分，同时在水浴过程中怕溶液沸腾，有一段时间没有加塞，所以溶液体积有一定的减小，同时有蒸汽中各种物质的污染影响。 七、注意事项 1.配置的酸性茚三酮溶液仅在24h内稳定，因此最好现用现配； 2.提取、反应要充分； 3.离心前必须平衡； 4.甲苯有毒，需格外小心。