《免疫组化基本技术》 倪灿荣.ppt

《免疫组化基本技术》 倪 灿 荣 主要内容 一、人体组织标本的取材 二、动物组织标本的取材 三、取材注意事项 四、细胞标本的准备 五、组织的固定、脱水、透明和包埋 六、切片 七、组织与细胞材料的保存 概 述 免疫组织化学（Immunohistochemistry; IHC） 技术是一门综合性技术，除了具备优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或标本的取材、固定、包埋、切片，以及IHC前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背景的消除方法，怎样防止IHC染色过程中的脱片。 一、人体组织标本的取材 手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。 1.手术切除标本的取材： 抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。组织大小：长1cm×宽1cm×厚0.2～0.3cm。 2.各种小组织的活检取材： 它不仅体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，及时固定，包埋时要平整。 2.注意防止人为因素的影响  刀和剪要快，刀要足够长。3.组织块的大小  厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定4.动物和人体组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定 5.取材时间 原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。 6.注意包埋方向 7.边缘标记 8.保持材料的清洁 9.切除不需要的部分10.明确编号，登记11.骨组织还需脱钙 四、细胞材料的准备 细胞的取材和制片法： 1.印片法：常用于活检或手术切除标本。将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载玻片上，吹干后立即固定20～30min。 优点：操作简单，抗原保存好缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背 景染色。 2.穿刺吸取法 3.沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。  （1）常规细胞玻片制片法 （2）单核细胞分离法 3.制备细胞玻片应注意 （1）易脱片； （2）细胞应集中在直径0.6～1.0cm的圆圈内，总数105-106； （3）富于粘液的标本，未经处理不宜做IHC。 4.活细胞标本的制备法 培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将 （1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。 （2）将细胞直接培养在盖玻片上。 （3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。 五、组织标本的固定 1.目的 (1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。 (2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。 （3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起 来而产生不同的折射率，造成光学 上的差异，以便染色后易于鉴别和 观察。（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、 增加组织硬度、便于制片。 （5）防止细胞过度收缩或膨胀而失 去其原有形态结构。（6）经过固定的组织能对染料产生 不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。 2.固定液的种类 (1)甲醛固定液  10％福尔马林 10％中性福尔马林 10％中性缓冲福尔马林 (2)4％多聚甲醛固定液(3)Bouin S液及改良Bouin S液(4)Zenker S液 重铬酸钾 25mg 氯化汞 10g  冰醋酸 50ml 蒸馏水 800ml (5)Zamboni S液 多聚甲醛 20g 饱和苦味酸 150ml PB液至 1000ml(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。 (7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加 入2.5%重铬酸钾25ml。(8)Kanovsky S液(9)Methacarn固定液 甲醇60ml，氯仿 30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备 用，对核内抗原的保存效果较好。 (1