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中国林蛙Dmrt基因的克隆测序及在不同组织中的表达 选题背景 研究目的及意义 研究内容 技术路线 预期效果 选题背景 林蛙的生物学特性及经济价值 Dmrt基因及其研究进展 简并PCR 选题背景 1林蛙的生物学特性及经济价值 生物学特性 中国林蛙（Rana temporaria chensinensis）隶属于两栖纲（Amphibia）无尾目（Anura）蛙科（Ranidae）蛙亚科（Raninae）林蛙属（Rana）。 林蛙体细胞的二倍体染色体是13对，5对是大型，8对是小型，雌雄个体之间没有发现异型染色体 。 经济价值 中国林蛙俗称哈士蟆、田鸡，主要分布于我国东北及华北，可食用和药用， 是一种重要的经济蛙类，由于雌性的输卵管（俗称哈士蟆油）是珍贵的药材，是滋补强壮之佳品，具有较高的经济价值，使得雌蛙的身价比雄蛙高出几倍。 选题背景 2 Dmrt基因及其研究进展 1）Dmrt基因 Dmrt基因(dsx and mab-3 related transcription factor)是指含有与果蝇dsx基因和线虫mab-3基因同源的基因。该基因有一个共同特征：即所编码的蛋白质都包含一个具有DNA结合能力的高度保守基序—DM结构域，DM( Dou-blesex and Male aberrant-3 relative do-main)结构域是在果蝇的性别决定基因double-sex（Dsx）编码的蛋白质中发现的,它是一个富含半肤氨酸的类似锌指的结构基序,通过锌指方式与特定的DNA序列相结合，并由此调控下游基因表达，控制着性别的分化和生殖腺的发育，参与不同个体性状的发育和器官的形成。 2）基因功能及研究进展 （1）基因功能： Dmrt基因家族的主要功能是参与性别决定与分化，参与许多组织、器官的形成及相关功能的维持。 迄今，在人类及其它动物中已克隆的Dmrt家族成员约有10个，对其功能的研究主要集中在Dmrt1~Dmrt4，其中参与性别决定（dsx和mab-3与Dmrt1、Dmrt2）；参与神经系统和感觉器官的发育（Dmrt3、Dmrt4等）；参与体节发育（ Dmrt3）；参与肾、鳃、骨骼肌形成和功能维持（ Dmrt2、 Dmrt3、Dmrt4）。 （2）研究进展： ①Dmrt1的研究进展 （Ⅰ）Raymond C等（1999）在XY雄性小鼠中研究发现，Dmrt1基因敲除会导致睾丸分化不完全甚至会导致生殖细胞死亡。 （Ⅱ）Marchand等（2000）对虹鳟鱼的研究表明，Dmrt1在精巢中特异性表达。 （Ⅲ） Ellegren等（2001）研究表明Dmrt1定位于Z染色体上，在鸡胚胎发育的性腺中特异表达，且精巢中表达量高于卵巢，一旦鸟类性腺分化方向确定，Dmrt1呈现为睾丸专一性表达。 （Ⅳ） Sreenvasulu等（2002）研究D表明Dmrt1在晰蝎发育第3天的生殖嵴中开始表达，随后仅限于间充质细胞，而间充质细胞将进一步发育成精巢足细胞。 （Ⅴ）Kazuyuki等（2002）对虎纹蛙的研究中表明，当用MPT (male-promoting temperatur)孵化受精卵时， Dmrt1在精巢分化时专一表达，在卵巢分化时无表达，成体组织中，在精巢组织中特异性表达。 （Ⅵ）季代丽等（2005） 在对黑斑蛙的研究中表明：Dmrt1只在精巢中特异表达,在卵巢、眼、肠、鳃及心脏组织中无表达。 （Ⅶ）杨东等（2008）采用RT-PCR技术对尼罗罗非鱼不同组Dmrt1基因的表达进行了研究，结果发现，Dmrt1只在精巢中特异表达，在卵巢、眼、肠、鳃及心脏组织中无表达。 ②其他Dmrt 基因的研究进展 （Ⅰ）Ottolengh等（2000）对一个46岁，XY性逆转妇女的组织进行研究表明Dmrt2基因作为发育基因，在不同的时空中发挥调控作用，使发育朝某一特定方向进行。 （Ⅱ）Smith CA等（2002）年的研究发现Dmrt2在鸡胚的早期尾部体节及后期的泌尿生殖系统中表达，Dmrt3在神经管发育中专一性表达，最明显时期是在E2-E3期。 （Ⅲ）Kim等（2003）在鼠胚胎期的脑中发现了Dmrt5表达，进一步用原位杂交发现E13.5期脑中有Dmrt5表达，同时还发现Dmrt6在大脑中也有表达，但表达水平很低。 （Ⅳ）Winkler C等（2004）的研究表明Dmrt2在青鳉