14-重组DNA技术-交课件.pptVIP

第十四章 重组DNA技术主讲教师：张涛 重组DNA技术的发展简史 1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉 第一节 重组 DNA技术的相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 宿主细胞 一、 克隆 克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 重组DNA技术 实现DNA克隆所采用的方法及相关的工作统称为重组DNA技术或重组DNA工艺学(recombinant DNA biotechnology)，又称为基因工程（遗传工程）。 二、工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 反转录酶 重组DNA技术中常用的工具酶 限制性核酸内切酶 分类 　　Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 　　（基因工程技术中常用Ⅱ型） 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。 同裂酶（isoschizomer） 识别同一序列，但切割位置不同，这类酶互称为同裂酶（isoschizomer）。 第二节 重组 DNA技术的基本原理 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 二、重组DNA技术步骤 1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 1. 什么是DNA克隆？什么是限制性核酸内切酶？ 应用酶学的方法，在体外将各种来源的DNA与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，就称为DNA克隆也称为基因克隆 。 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 2. 什么是基因组文库？什么是cDNA文库？ 采用物理方法或限制性核酸内切酶将染色体DNA切割，继而将所获得的片段与适当克隆载体连接，将重组DNA转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就涵盖了基因组全部信息，这个携带所有基因组DNA的集合即称为基因组文库。 以细胞mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增后可获得含有相应cDNA的大量克隆，这些克隆就构成了cDNA文库。 3. 重组DNA过程中所需要的酶主要有哪些？ 4. 重组DNA技术的基本步骤有哪些？ 5. 重组DNA技术在医学上有哪些应用？ ①进行致病基因的发现 ②进行疾病的分子诊断 ③进行基因治疗 ④用于发展生物制药 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA导入受体菌 （五）重组体的筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶联免疫检测分析等 (插入失活法) 抗药性标记选择 组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油