单克隆和基因工程抗体制备4.ppt

抗体制备技术 抗体是生物学及医学领域中应用最广泛的制剂。 　抗体制备技术的发展已经历了三个阶段： 1、用纯化抗原免疫动物获得的血清, 多克隆抗体(PcAb)为第一代抗体， 2、用B细胞杂交瘤技术制备的 单克隆抗体( McAb)为第二代抗体， 3、第三代为基因工程抗体。 目前临床上使用的单克隆抗体和多克隆抗体均为动物源性抗体，具有免疫原性，在反复使用时常会诱导机体的免疫应答而产生抗抗体，这大大限制了异源性抗体在人体内的应用。随着基因工程技术的发展，人们逐渐可根据需要制备各种特异性的抗体，通过降低抗体的免疫原性，获得更佳的生物学活性。 3、基因工程抗体又称重组抗体， 是指应用NDA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。 第一节 免疫血清的制备 五、抗体的纯化和鉴定 是 B 细胞系恶性肿瘤，具有在体外长期增殖的特性。 3. 选择性培养基的作用原理 　　HAT培养基中的氨基蝶呤为叶酸拮抗剂，故所有细胞的DNA合成主要途径被阻断，只能由辅助途径合成DNA。 4. 制备单克隆抗体的技术流程 （一）杂交瘤技术流程 （二）技术要点 根据抗原的性质及所需单克隆抗体的功能， 常用方法有RIA、ELISA、免疫荧光等，鉴定 抗体的特异性、亲和力 、纯度等。 大量生产分体内和体外两种方法，目前以体内法为主。先给小鼠腹腔注射降植烷，造成无菌性腹膜炎，7天后将杂交瘤注入小鼠腹腔，10—14天后从小鼠腹腔获得高浓度的单克隆抗体。 三、单克隆抗体的应用 可大量生产且稳定性好 第二节?? 基因工程抗体技术 ? 基因工程抗体又称重组抗体，是指应用NDA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。 目前临床上使用的单克隆抗体和多克隆抗体均为动物源性抗体，具有免疫原性，在反复使用时常会诱导机体的免疫应答而产生抗抗体，这大大限制了异源性抗体在人体内的应用。随着基因工程技术的发展，人们逐渐可根据需要制备各种特异性的抗体，通过降低抗体的免疫原性，获得更佳的生物学活性。 目前基因工程抗体技术主要包括两部分内容： 一是应用DNA重组和蛋白工程技术对已有的单抗进行改造，包括人源化抗体、小分子抗体、双价特异性抗体和抗体融合蛋白等的制备； 二是用抗体库技术筛选、克隆新的单抗。 一、人源化抗体 （一）嵌合抗体 嵌合抗体（chimeric antibody）又称人-鼠嵌合抗体，是从杂交瘤细胞中分离出鼠源单抗功能性V区基因，经基因重组与人抗体C区基因连接成嵌合基因后，插入适当的表达载体中，再共同转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体分子。 嵌合抗体保留了单抗对抗原的特异亲和性，又含有人抗体C区的成分及其功能。 1．抗体V区基因的克隆 　准确获得抗体可变区基因是制备嵌合抗体的关键所在。 鼠源单抗VL和VH基因可通过以下两种方法获得： ①用适当的探针从其杂交瘤细胞系的基因组文库中筛选出V区基因； ②用PCR方法从该细胞的RNA或mRNA中扩增所需的V区基因。 2．抗体C区的选择 　 抗体恒定区基因的序列相对恒定，比较容易得到，可根据需要进行选择。如选择人IgG1或IgG3的恒定区可使嵌合抗体保留其介导抗体依赖性细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）和增强激活补体的能力,如果抗体只是用于激活和阻断受体时，可选择人IgG2或IgG4恒定区。 3．表达载体的构建 　为了产生具有功能活性的人-鼠嵌合抗体，需要将编码V区和C区的基因插入表达载体。 构建表达载体的方法主要有二种：①分别构建表达VL和VH基因的载体，用两个载体分别带上不同的标记基因，通过二次转染（将载体DNA导入真核细胞称为转染）选择获得嵌合抗体基因的细胞；②将VL和VH基因构建于同一载体中，这样虽然增加了重组体构建的难度，但可提高转染的成功率，同时增加表达量。 4．表达 嵌合抗体的重组基因一般利用哺乳动物细胞等进行表达。因为抗体分子需要经过正确的装配和加工等过程才能维持其生物学功能，而原核细胞等往往不能表达完整的抗体，只有哺乳动物细胞能够表达具有良好功能的抗体。 （二）改形抗体 改形抗体（reshaped antibody，RAb）是应用基因工程技术在嵌合抗体基础上用人抗体可变区的骨架区序列取代鼠源单抗CDR以外的骨架区序列，重新构成既有鼠源单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体，该抗体对人体几乎无免疫原性。 二、小分子