木糖 木糖异构酶的锚定位置-免疫荧光检测.ppt

开发和利用生物质资源 是一个长期战略目标 可再生的生物质资源：1500-2000亿吨/年 化工技术 微生物技术 能源、化工产品和食物 未来经济体系的基础: 石油资源 生物质资源 中期发展战略---开发生物质清洁燃料 可再生资源 木质纤维素 发展生物质燃料的重大战略意义 减少石油进口；平衡外汇收支；保证国家安全 促进农村经济发展；增加就业机会；保持社会稳定 改善城市大气质量；实现封闭的碳循环，减少二氧化碳净排放，减轻温室效应 中国的生物质资源 中国年产5-6亿吨粮食，部分产粮区出现阶段性、结构性生产过剩 另有约10亿吨农林残余物和含纤维物质的城市垃圾等，大部分未充分利用，有些还造成污染 不宜农作物的土地 可栽培能源作物 纤维类生物质的两种转化方式 酶水解 酶的成本高 受原料变化影响 原料需要预处理 水解较慢 戊糖共发酵微生物 产业化举例 – BCI – Bagasse, Rice Hulls 酸水解 酸回收或废弃 设备材料昂贵 产糖率较低 需要去除有毒副产物 戊糖共发酵微生物 产业化举例 – Masada – MSW, Sewage Sludge 纤维素酒精生产的经济可行性 经过二十多年努力，美、加、日等国已完成吨级中试，推算的生产成本接近粮食酒精水平，正在筹备建厂 目前 1.16-1.44美元/加仑酒精，可作为增氧剂加入汽油 通过技术进步，成本可降低 40美分以上（NREL 1999：61.5美分/加仑），可完全替代汽油用作燃料 植物纤维原料预处理技术 对植物纤维原料预处理，可以提高纤维素的可降解率 主要有物理、化学预处理技术，如辐射处理、粉碎、高压热水、有机溶剂、稀酸、低温浓酸、酸催化的蒸汽水解、蒸汽爆碎、液氨爆碎、碱水解及使用非离子表面活性剂等。 过去10年中，生物技术使乙醇成本从﹩1.0/L 降至﹩0.3～0.5/L，据预测若充分利用原料中的可发酵性糖，成本可再降25％ 酒精生产理想的微生物： 广泛的底物利用性，高产量、高产率；具有较高的对乙醇及木质纤维材料水解产物中的毒性物质的耐受性；较好的生物安全性 通过微生物代谢工程改造： 拓展乙醇发酵底物 促进中间产物代谢产物转化为乙醇 丰富的木糖资源 木糖是木质纤维素水解物中含量仅次于葡萄糖的组分 S. cerevisiae 木糖代谢工程菌中存在的 主要问题: 下游反应的疏通 木糖的穿膜运输 XR和XDH催化的反应的偶联 XI途径的建立 重组酿酒酵母木糖还原酶（XR）及木糖醇脱氢酶（XDH）的比活力 重组酿酒酵母50小时发酵产物分析 细菌木糖异构酶基因xylA 的克隆及在酿酒酵母中的表达 基因来源 ： 嗜热细菌Thermus thermophilus T.thermophilus xylA的定点诱变 重组菌株XI最适酶活测定 木酮糖激酶的超表达----下游反应的疏通: 木糖代谢，木酮糖在木酮糖激酶(XK)的作用下，生成磷酸木酮糖，进入PPP途径，木酮糖高效转化为磷酸木酮糖，可减少木糖醇的积累，使木糖代谢流向乙醇生成的方向。在酿酒酵母菌中，具有XK活性，但一般认为其活性较低。 基因XYL1、XYL2 来源：Pichia stipitis 质粒 pMA91－PGKp.t 选择标记：LEU2基因XYL3来源： S. cerevisiae NAN-27质粒：YEp24－ PGKp.t 选择标记：URA3 H158－－实验室菌株（MATα leu2-3 leu2-112  ura3-52 trp1-289 his4-519 prb1cir+ ）共转化 木糖异构酶的锚定位置 ——免疫荧光检测 以酒精酵母工业菌株为受体菌， 生理生化实验: 木糖的生长实验 木酮糖激酶酶活的测定 工业菌株转化体系 抗性标记的选择及载体构建 敏感性的测定 转化方法改进 rDNA 的克隆 XR、XDH途径： 质粒pYMIK-xy127的构建流程图 工程菌株NAN-127酒精发酵的过程控制 发酵培养基的优化 接近木质纤维素水解物的碳源配比 更经济的氮源加量 分批发酵工艺优化（小罐） 溶氧条件 pH 不同木糖代谢工业工程菌株共发酵木糖和葡萄糖发酵性状比较 纤维素酶近期研究内容 耐极端环境酶系的选育和分子改造 单一酶组分高产工程菌构建 酶系生成的调节机理和人为控制 复合酶系的协同作用和分子重组 酶生产技术及其应用 纤维素降