项目2黄色短杆菌常规染色和菌种诱变技术.pptVIP

微生物中的细菌，其细胞小而透明，用压滴片或悬滴片在光学显微镜下观察时，菌体和背景没有明显的明暗差，不易看清其形态，更难以识别它们的结构。因此，需要对菌体进行染色，借助于染料使菌体着色后颜色的反衬作用，观察细菌的形状、基本结构(壁、膜、细胞质、核及内含物)及附属结构(荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等)。 简单染色又称单染，只用一种染料使菌体着色。若仅为在显微镜下看清细菌形态，用单染即可。 复染是指用两种或多种染料染细菌，目的是鉴别不同性质的细菌，主要方法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。 革兰氏染色步骤是：先用草酸铵结晶紫染色，经媒染剂碘-碘化钾溶液处理后用乙醇脱色，最后用沙黄染液（也称蕃红染液）复染。如细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被脱色，用蕃红液复染后仍呈紫色，则该细菌称为革兰氏阳性菌（G+）；被乙醇脱色用蕃红复染后呈现红色，则称为革兰氏阴性菌（G-）。现在已知，革兰氏染色结果与细菌细胞壁的结构组成有关。 2.染液 ①简单染液：齐氏石炭酸复红染液 ②革兰氏染液 草酸铵结晶紫染液(染液) 卢戈氏碘液(媒染剂) 95％乙醇或丙酮(脱色剂) 沙黄乙醇溶液(复染剂) 吕氏美蓝染液。 3.用具 显微镜、酒精灯、接种环、无菌水、香柏油、二甲苯、牙签、载玻片、纱布、滤纸、镜头纸、镊子、染色缸、火柴、玻片架、烧杯等。 ②风干 在空气中自然干燥。切勿在火焰上烘烤。 ③固定将已干燥的涂片向上，在微火上迅速通过2～3次，使得菌体与玻片结合牢固。 2.染色 1.用金黄色短杆菌制简单染色片，在油镜下观察。 2.用金黄色短杆菌制革兰氏染色片，油镜下观察，区别革兰氏阳性菌和阴性菌。 3. 培养基和试剂 ① 无菌水、75%酒精 ② 0.5％碘液 碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。 ③ 选择培养基 可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，NaCl 0.5g，琼脂2g，蒸馏水100mL，pH6.8～7.0，121℃灭菌20 min。 ④ 肉汤培养基 牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，蒸馏水100mL ，pH7.2～7.4，121℃灭菌20 min。 3.诱变处理 将菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30cm）照射0.5-1min。 4.取0.1-0.2mL诱变后菌悬液于选择培养基平板上，用涂布器涂匀。置37℃暗箱培养48h。 5.在长出菌落的周围滴加碘液，观察并测定透明圈直径（C）和菌落直径（H），挑选C/H值最大者接入斜面保藏。 训练项目2 2 紫外线诱变选育谷氨酸高产菌株 制药微生物发酵技术 紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。 1. 菌种 产淀粉酶枯草芽孢杆菌 2. 器材 装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球 一、材料与用具 训练项目2 2 紫外线诱变选育谷氨酸高产菌株 制药微生物发酵技术 训练项目2 2 紫外线诱变选育谷氨酸高产菌株 制药微生物发酵技术 1.菌体培养 取枯草芽孢杆菌一环接种于盛有20mL肉汤培养基的250mL三角瓶中，于37℃振荡培养12h，即为对数期的菌种。 2.菌悬液的制备 取5mL发酵液于10mL离心管中，以3000 r/min离心10min，弃去上清液。加入无菌水9mL，振荡洗涤，离心10min，弃去上清液。加入无菌水9mL，振荡均匀。 二、方法 训练项目2 2 紫外线诱变选育谷氨酸高产菌株 制药微生物发酵技术 训练项目2 2 紫外线诱变选育谷氨酸高产菌株 制药微生物发酵技术 1.紫外线对人体的细胞，尤其是人的眼睛和皮肤有伤害，长时间与紫外线接触会造成灼伤。故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。 2.空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。臭氧过高，会引起人不舒服，同时也会影响菌体的成活率。臭氧在空气中的含量不能超过0.1％-1％。 NOTE: 2 紫外线诱变选育谷氨酸高产菌株 制药微生物发酵技