基因工程LH.docVIP

基因工程的目的： 采用DNA重组技术从不同生物基因组中优良性状相关的基因克隆，转移同一生物基因组中，培育出具有高度应用价值的新物种。 目的基因： 优良性状相关的基因，即用于克隆的基因。 目的基因包括： 蛋白（酶）基因、抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物讲解相关的基因等。 结构基因组成 1.原核生物的基因组成 （1）基因区：操纵子形式存在，但各基因分别有 ATG的起始密码子和TAA（TAG、TGA）的终止密码子。 （2）启动区：RNApol识别、结合和开始转录的一 段DNA核苷酸序列。 （4）转录终止子和终止因子 转录终止子：一个基因或一个操纵子3′端，提供转录停止信号的DNA核苷酸序列。 终止因子：协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子的蛋白。 （1）质粒的基因：少量结构基因、基因组成简单，启动子、 编码区和终止子，无内含子。 （2）病毒的基因：多顺反子、重叠基因、有的基因含有内含 子。 （3）线粒体的基因：能源代谢相关的基因、多顺反子、动物 Mt基因没有内含子，而植物Mt基因含有 内含子，有的没有。 （4）叶绿体的基因：光合作用相关的基因，多顺反子形式进 行转录，具有原核生物相似的启动子。 5.1.2 基因的排列 基因组的每个基因一般一个一个直线排列在DNA分子上，并且两个基因之间存在非编码的间隔序列，但存在一些特殊排列。 1.重 叠 基 因 核苷酸序列彼此重叠的基因，即不同基因共用同一段DNA的核苷酸序列，他们的核苷酸序列彼此重叠。 2.重复基因（repeated gene or duplicated gene） 原核生物基因组 — 单拷贝基因 真核生物基因组 — 约30%的基因是多拷贝 3. 加倍基因 高等生物：2n = 两套基因组 原核生物： n = 一套基因组 蓝 藻： 多倍性染色体，存在多套基因，不易获得基因突变体 4. 基 因 重 排 有的基因组中，同一基因簇处在不同细胞中时，基因排列会发生变化。 5.2 目的基因的制备 分离的基因：有功能的基因：启动区、编码区和终止区 操纵子：启动子、功能相关的编码基因和终止子 编码区：只分离ORF promoter or terminator 目的基因的制备方法 直接分离法 构建基因文库分离法 聚合酶链式反应PCR分离法 化学合成法 1.直接分离法 一、限制性核酸内切酶酶切分离法 1.对已知序列的DNA分子； 2.对已知定位的目的基因； 3.对未知序列未知定位的基因。 二、基因分离的物理化学法 该方法是基因工程发展初期所用的方法。根据不同基因片段碱基组成不同，理化性质（沉降系数、解链温度）的差异采用相应的方法分离目的基因，但目前已很少采用。 （1）密度梯度离心法 其原理是GC含量高DNA片段的浮力密度较高，而富含AT的 DNA片段的浮力密度低，利用密度梯度超速离心技术可以分离GC含量较高的目的基因片段。 (2)单链酶解法 （3）分子杂交法（Molecular hybridization) ssDNA与其互补的核苷酸序列配对形成dsDNA，这就是分子杂交的原理。 三、双抗体免疫法分离编码蛋白的基因（真核） 条件：纯化目的基因的天然蛋白、制备抗天然蛋白的抗体。 四、利用酶促反转录法分离基因 主要用于合成分子质量较大，转录产物mRNA易分离目的基因。 5.2.2 构建基因组文库的的分离法 DNA文库—具有扩增能力的各种DNA片段的混合体。 如果文库的容量足够大，就能包含该物种或该组织 全部DNA或RNA（以cDNA的形式）的序列。 基因组文库—由于基因组文库来自于某一物种的基因组，而该物种所有组织中的基因组均相同，所以基因组文库具有种属特异性，但无组织特异性。文库—cDNA文库来自于某一物种某种组织的RNA，所以cDNA文库既有种属特异性，也有组织特异性。 1. 含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和 2.基因组文库的大小 理论值: 基因组文库的克隆数目＝基因组DNA总长/DNA插入片段的平均长度。 3. 建立基因组文库的一般程序 1．载体DNA片段的制备 DNA分离纯化 → 限制酶切 → 脱磷酸化反应 2． 供体DNA片段的制备 总DNA分离纯化→ 机械剪切法→ 分离特定大小DNA片段 超声波～300bp，剧烈搅拌：～8Kb 酶法 部分酶切 分离特定大小