annexina2抗体制备及其应用的实验分析word格式论文.docxVIP

内 容 摘 要目的：为了研究人源膜联蛋白 A2（AnnexinA2）在肿瘤发生发展中的作用，探 讨 annexinA2 作为肿瘤分子靶点在肿瘤诊断及治疗中的应用，我们制备了其多克隆及 单克隆抗体并进行了相关研究。方法：（1）用 PCR 克隆人的 AnnexinA2 的基因编码区，将其克隆入原核表达载 体 pET28a(+)，构建原核表达质粒 pET28a(+)/AnnexinA2.(2)将构建的原核表达质粒转 化到大肠杆菌 E.co li BL21(DE3)中，用 IPTG 诱导目的基因的表达，通过超声裂解和 SDS检测重 组 蛋白的 表达。 表达的 蛋白产 物利用 切胶回 收的方 法纯化， SDS检测纯化情况，Western Blot 鉴定重组蛋白。(3) 将纯化并透析、浓缩的重 组蛋白免疫兔子，耳缘静脉取血测定兔血清的效价，效价达到 300000 以上，动脉插 管取血，收获的兔血清既为多克隆抗体。用间接 ELISA 方法测定抗体的效价，用 Western blot 检测抗体的特异性，用细胞免疫荧光及 FCM 法检测细胞的定位。（4） 将纯化并透析、浓缩的重组蛋白免疫 Balb/C 小鼠，取效价最高的小鼠作为待融合小 鼠；分离该小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 SP2/0 进行融合，通过 HAT 选择性培养基培养， 间接 ELISA 法筛选，用有限稀释法单克隆化，获得稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细 胞株。将阳性单克隆细胞腹腔注射至小鼠腹腔，收获腹水离心后的腹水上清作为单克 隆抗体。用间接 ELISA 检测抗体的效价，Western Blot 和免疫共沉淀检测抗体的特异 性。（5）将制备的抗体应用于 Western Blot、细胞免疫荧光(CIF)和流式细胞术（FCM）， 检测真核细胞中目的蛋白的本底表达情况。（6）用外源的 annexinA2 单克隆抗体处理 HepG2 细胞，用 MTT 法检测外源性抗体对细胞生长增值的影响；FCM 检测细胞周期； RT-PCR 和 real-PCR 检测细胞周期的相关基因；western blot 检测细胞周期相关基因中 CDK6 的表达情况；用划线法及 transwell 检测外源抗体对 HepG2 细胞的侵袭及迁移 的影响结果：（1）经酶切和 DNA 测序鉴定，pET28a(+)/AnnexinA2 原核表达质粒的构建是 正确的。（2）原核表达质粒转化大肠杆菌 E.coli BL21 (DE3)，1.0mM IPTG 可诱导 AnnexinA2 重组蛋白的表达，表达的重组蛋白以包涵体的形式存在。运用切胶回收的 方法纯化重组蛋白，SDS分析其纯度均在 80%以上，Western Blot（WB）鉴定 显示重组蛋白各自兼有 6×His 的标签。（3）将纯化的蛋白免疫日本大耳白兔后，制备 了特异的高滴度的多克隆抗体( ELISA 滴度达 1：640000)。Western blot（WB）检测 抗 体 的 具 有 较 好 的 特 异 性 。 CIF 和 FCM 结 果 显 示 抗 血 清 与 肿 瘤 细 胞 表 达 的 annexinA2 有高度特异的结合活性。(4) 将纯化的重组蛋白作为抗原免疫 Balb/C 小鼠 后，经融合、筛选和克隆化，获得了四株阳性单克隆细胞株，并制备了腹水上清形式的单克隆抗体。ELISA 检测四株单克隆抗体的效价均在 1280000 以上。就其中的一株单抗经 western blot 鉴定，制备的单抗不是 6×His 标签抗体。经 western blot 鉴定单克 隆抗体能特异性识别 PC3（前列腺癌细胞）、ECV（人血管内皮细胞）、T24（膀胱癌 细胞）、HepG2（肝癌细胞）、PANC1（胰腺癌细胞）及癌组织表达的 annexinA2 蛋白， 而在癌旁组织中仅仅检测到很少量的本底表达的 annexinA2 蛋白；免疫共沉淀进一度 证实了单克隆抗体能特异性识别肝癌细胞内本底表达的 annexinA2 蛋白。CIF 和 FCM 结果显示腹水形式的单克隆抗体与肿瘤细胞表达的 annexinA2 有高度特异的结合活 性。（5）MTT 结果表明，与对照细胞相比较，外源的 annexinA2 单克隆抗体能够抑 制 HepG2 细胞的生长，并且随着抗体处理浓度的降低，抑制 HepG2 细胞生长的能力 减弱；FCM 结果显示，外源的单克隆抗体促使 G1 期延长，G2+M 期的时间缩短，促 使 HepG2 细胞的生长周期阻滞在 G0+G1 期；RT-PCR 和 real-PCR 结果显示，与对照 细胞相比较，外源的单克隆抗体对 HepG2 细胞周期的相关基因的表达有一定的影响， 抑制了细胞周期相关基因 hCCD1，hE2F1，CDK6 的表达，并且随着抗体处理浓度的 降低，抑制 hC