anxa10对人原发性肝癌细胞株hepg2中的vegfa akt3 pik3ca基因表达影响的研究word格式论文.docxVIP

摘 要目的：1、构建携带增强绿色荧光蛋白（EGFP）的人膜联蛋白 A10 基因（ANXA10） 过表达慢病毒，然后转染人肝癌细胞株 HepG2。2、采用转录组测序的方法检测 ANXA10 过表达慢病毒对 HepG2 基因表达 谱所产生的影响，初步阐明 ANXA10 对 HepG2 生物学行为的影响、可能涉及的 基因及相关的信号通路，为原发性肝癌形成中的 ANXA10 作用的深入研究奠定 基础。方法：构建携带增强绿色荧光蛋白（EGFP）的人膜联蛋白 A10 基因（ANXA10） 过表达慢病毒 LV-ANXA10，体外培养的 HepG2 分为三组：实验组、空载体对 照组和空白对照组，各组分别转染 LV-ANXA10、慢病毒空载体以及等量的 Polybrene（病毒及空载体以 MOI=10 浓度转染），转染 72 小时后使用荧光倒置 显微镜观察增强绿色荧光蛋白（EGFP）的表达情况，从而来确定 ANXA10 的转 染效率，转染后 96 小时和 120 小时分别提取三组细胞的 RNA 行转录组测序比 较三组细胞相同时间点及同组细胞不同时间点基因表达谱的差异，并采用 qPCR 验证部分差异表达基因。结果：1、ANXA10 过表达慢病毒能影响 HepG2 的基因表达谱。通过对转录组信 息的分析，发现在转染后 96 小时的空白对照组与实验组比较发生显著转录差异的基因有 69 个，其中 26 个基因上调，43 个基因下调；空载体对照组与实验组相比发生显著转录差异的基因有 53 个，其中 25 个基因上调，28 个基因下调；空载体对照组与空白对照组比较发生显著转录差异的基因有 12 个，其中 8 个基 因上调，4 个基因下调。而在转染后 120 小时的空白对照组与实验组的比较中发 生显著转录差异的基因有 742 个，其中 110 个基因上调，632 个基因下调；空载体对照组与实验组的比较中发生显著转录差异的基因有 313 个，其中 168 个基 因上调，145 个基因下调；空载体对照组与空白对照组比较发生显著转录差异的 基因有 36 个，其中 24 个基因上调，12 个基因下调。进一步研究发现在转染 96 小时及 120 小时，实验组与空载体对照组及空白对照组比较 VEGFA、AKT3、IIPIK3CA 的表达均是下调的，而空载体对照组与空白对照组比较无上述变化。2、采用荧光定量 PCR 技术验证，其结果表明，两个时间点的实验组与空载 体对照组及空白对照组三组比较，实验组中 VEGFA、AKT3、PIK3CAmRNA 表 达明显下调，差异有统计学意义（P0.05），但空载体对照组与空白对照组相比 较无明显差异（P0.05），与转录组测序的分析结果吻合，从而证实 VEGFA、 AKT3、PIK3CA 在转染过表达慢病毒 ANXA10 的 HepG2 细胞和转染空载慢病 毒的 HepG2 细胞及 HepG2 细胞的表达的差异性。结论：1、ANXA10 过表达对 HepG2 基因表达谱有影响。2、ANXA10 过表达对人肝癌相关的细胞因子 VEGFA、AKT3、PIK3CA 可 能存在抑制效应。关键字：慢病毒；膜联蛋白 A10；转录组测序IIIABSTRACTObjective：The overexpression recombinant lentiviral of human ANXA10 gene with enhanced green fluorescent protein (EGFP) was constructed , then transfected into human hepatocellular carcinoma cell line (HepG2).The effects of overexpression lentiviral of human ANXA10 gene on gene expression profiles of human hepatocellular carcinoma cell line (HepG2) was examined by Transcriptome sequencing,the effect of the biological behavior of ANXA10 on HepG2 ,related genes and signaling pathways was illuminated initially so as to lay a foundation for the study on ANXA10 in the formation of primary liver cancer.Methods：The overexpression lentiviral of human ANXA10