ascs结合可降解pllapcl纳米纤维支架构建功能性尿道的可行性分析word格式论文.docx

支架上培养，免疫荧光活死细胞染色（Live/DeadStain）检测材料的细胞毒性、免疫荧光染色及扫描电镜比较细胞在不同材料上的粘附、增殖差异。5．材料的组织相容性及材料体内降解检测将不同比例无菌材料种植于SD大鼠鼠背皮下，免疫组化检测不同时间材料种植部位炎症标志因子CD31、CD45、CD68 表达情况，评估大鼠对材料的炎症反应以及观察材料的形态变化，了解材料在体内的降解情况。二．细胞外基质(extracellular matrix, ECM)改良PLLA/PCL纳米纤维支架性能。1．不同ECM（明胶、胶原、层粘连蛋白(LN)、纤维链接蛋白(FN)、高浓度多聚赖氨酸、低浓度多聚赖氨酸）处理96 孔板及1：1 PLLA/PCL纳米纤维支架，MTT 法检测不同ECM处理前后，96 孔板中细胞增殖能力变化；免疫荧光染色及扫描电镜比较支架材料不同ECM处理前后，细胞粘附能力变化。2．不同ECM（明胶、胶原、层粘连蛋白(LN)、纤维链接蛋白(FN)、高浓度多聚赖氨酸、低浓度多聚赖氨酸）预处理培养皿后种植ASCs，在平滑肌诱导培养基(smoothmuscleinductivemedium,SMIM)中诱导ASCs向平滑肌方向分化。RT-PCR和Realtime-PCR检测不同时相，普通培养皿和ECM处理培养皿内诱导细胞平滑肌特异性标记基因（Calponin、SM22、?-SMA、MHC）mRNA的表达及表达量的变化；Western blot检测其蛋白质的表达水平。进而比较不同ECM对ASCs向平滑肌方向分化的影响。三．方向性PLLA/PCL纳米纤维支架上ASCs成平滑肌分化及兔尿道重建。1．制备具有方向性的PLLA/PCL纳米纤维支架，扫描电镜检测材料的方向性。2．ASCs与方向性的PLLA/PCL纳米纤维支架在普通培养基（DMEM）中共培养，免疫荧染色、扫描电镜及MTT法检测材料上细胞的粘附、增殖。3.ASCs结合使用或不使用LN预处理的PLLA/PCL纳米纤维支架在平滑肌诱导培养基（SMIM）中共培养，扫描电镜观察LN处理前后，ASCs的粘附、分化及诱导出的平滑肌（AD-SMCs）的排列。4. 兔尿道狭窄模型的建立及带细胞支架兔尿道修复应用钬激光在直视下对兔尿道行破坏，术后3-4 周逆行尿路造影显示尿道狭窄形成。从该兔腹股沟区取脂肪组织，分离出ASCs并在体外培养增殖。将扩增的细胞种植于方向性纤维支架上，普通培养基（DMEM）内培养一周，细胞增殖密集后，换用诱导培养基（SMIM）诱导ASCs 向平滑肌分化。成功诱导ASCs为AD-SMCs后，将带细胞支架移植于ASCs来源兔尿道内，不同时间点检测兔尿道压变化（2 周、8 周），并与尿道狭窄模型建立前，兔尿道压相对比，评估带细胞支架的治疗效果。结果1. 从兔三个不同部位分离出的细胞都具有脂肪干细胞典型的三角形或梭形外观，流式细胞仪检测细胞表面CD106、CD166阳性率同脂肪干细胞吻合。2. 不同部位ASCs体外增殖能力MTT法检测，差异有显著性（P0.05）。颈背部增殖能力最强，其次为腹股沟区，腹膜后脂肪来源（肾周脂肪）增殖能力最弱。3. 电镜下观测静电纺丝技术成功制备出具有方向性的纤维支架材料。4. 免疫荧光活死细胞染色（Live/Dead Stain）检测，不同组分PLLA/PCL纳米纤维支架均无明显细胞毒性。免疫荧光活死细胞染色和扫描电镜观测不同时间点（1、2、3 天）固定面积视野细胞计数，1：1 支架材料细胞粘附能力最强，不同材料上细胞增殖能力没有明显差异（P0.05）。5. 不同支架材料种植与SD大鼠背部皮下后，第5 天、第2、3、4、6、8、12 周免疫组化染色。仅仅第5 天时，炎性因子CD31、CD45、CD68有阳性表达，第2、3、4、6、8、12 周免疫组化检测炎症因子CD31、CD45、CD68均无明显阳性表达，并观察到材料逐渐破碎降解，第12 周时，基本看不到组织中材料成分，而且材料种植部位无肉芽组织形成。6.倒置像差显微镜下，计数不同ECM处理材料（1：1 材料）后，相同面积材料上粘附的细胞数与未用ECM处理材料上细胞数对比，ECM处理后各组相同面积材料粘附数与未处理组有明显差异（P0.05）。7. 不同ECM处理培养皿中细胞增殖能力与未处理培养皿中细胞增殖能力对比，PLL高浓度组、PLL低浓度组、FN组与对照组有明显差异（P0.05）；明胶、胶原、LN处理组与对照组无明显差异（P0.05）。8. 不同ECM处理培养皿后接种ASCs，在诱导培养基中诱导6周。Realtime-PCR 检测显示不同ECM处理组，平滑肌特异性基因表达水平均随诱导时间延长而升高，6 周时各种处理因素平滑肌特异性基因表达水平达到基本一致水平（成功诱导为SMCs）。LN、明