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Beclin1 基因的选择性剪接研究及条件敲除小鼠的建立中文摘要中文摘要第一部分 Beclin1 基因的选择性剪接研究目的：研究儿童急性 B 淋巴细胞白血病 697 细胞系中的 Beclin1 基因的选择性 剪接及其对自噬的调控作用。方法：（1）提取 697 细胞系的总 RNA，逆转录成 cDNA。（2）在 Beclin1 基因的 ORF 区的起始密码子上游和终止子的下游设计引物， 以 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增、测序和比对。（3）分析剪接体 Del-E11 产生的分子机制。（4）构建 GFP-剪接体融合表达的慢病毒载体，研究其亚细胞定位。（5）构建剪接体融合表达的 697 细胞系，通过 western blot 和 Co-IP 的方法检 测 Del-E11 对细胞自噬的调控作用。结果：（1）在儿童急性 B 淋巴细胞白血病 697 细胞系中发现一个新的 Beclin1 基因 剪接体，该剪接体第 11 号外显子缺失，导致翻译提前终止，形成的肽链和 Beclin1 相比在 C 端缺少了 95 个氨基酸。（2）成功构建 Lenti- GFP-Beclin1 和 Lenti-GFP-Del- E11 融合基因的慢病毒表 达 载 体 ， 包 装 病 毒 后 ， 侵 染 Hela 细 胞 ， 得 到 阳 性 的 Hela-GFP-Beclin1 和 Hela-GFP-Del-E11 细胞，western blot 检测结果表明融合基因正常转录并翻译成相 应蛋白。（3）亚细胞定位实验结果表明 Del-E11 蛋白主要分布于细胞质中。（4）过表达 Del-E11 抑制 697 细胞系中的自噬活性。 结论：（1）生 物信息 学分析 表明， Beclin1 基因 的缺失突 变体 Del-E11 是由于pre-mRNA 选择性剪接时发生外显子跳跃形成的。（2）Del-E11 蛋白与野生型的 Beclin1 蛋白在细胞质中均有分布，表明二者在 亚细胞定位方面没有明显变化。中文摘要Beclin1 基因的选择性剪接研究及条件敲除小鼠的建立（3）由于 Del-E11 蛋白与 Vps34 结合的能力下降，导致 697-Del- E11 细胞的自噬水平显著低于 697-Beclin1 细胞的自噬水平，表明 Del-E11 对自噬具有负调控 作用。关键词：Beclin1；可变剪接；自噬；免疫共沉淀；亚细胞定位第二部分 Beclin1 基因条件敲除小鼠的建立目的：建立 Beclin1 基因条件敲除小鼠模型。 方法：（1）NeoR 滋养层细胞的制备。（2）限制性内切酶 AsiSI 线性化 Beclin1 打靶载体。（3）小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）的培养、ES 细胞的电穿孔 及阳性 ES 克隆的筛选和鉴定。（4）制备结扎公鼠及假孕雌鼠。（5）雌鼠动情周期的判定和超数排卵。（6）小鼠胚胎的获取、显微注射和胚胎移植。（7）嵌合体的筛选与繁育。（8）N4 代 Beclin1f/+小鼠的基因型鉴定与繁育。（9）Vav-Beclin1+/-小鼠的基因型鉴定。 结果：（1）从 144 个中靶的 ES 细胞克隆中鉴定出 18 个阳性的 ES 细胞克隆。（2）选取 3 株阳性 ES 克隆，共注射 145 枚囊胚，移植给 10 只假孕雌鼠，产生 24 只嵌合体，其中雄鼠 14 只，雌鼠 10 只。（3）筛选出 4 只嵌合度在 50%以上的雄鼠进行繁育，最终共获得 19 只 N4 代 小鼠，其中有 12 只是 Beclin1f/+小鼠。（4）获得 4 只 Vav-Beclin1+/-小鼠。结论：成功建立 Beclin1 基因条件打靶小鼠模型，并在血液细胞中特异性地敲 除 Beclin1 基因。关键词：Beclin1；条件性基因敲除；Cre/loxP 系统作者：刘青青 指导老师：薛智谋Studies on Alternative Splicing of Beclin1 and Generation of Beclin1 gene Conditional Knockout M iceAbstractStudies on Alternative Splicing of Beclin1 Gene and Generation of Beclin1 Conditional Knockout MiceAbstractPart 1 Studies on alternative splicing of Beclin1 geneObjective: To explore alternative splicing of Beclin1 gene and its role in the regulation of autophagy in human B-ac