外源基因在酵母菌中表达.pptVIP

外源基因在酵母菌中的表达 A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 酵母菌的宿主系统 C 酵母菌的载体系统 D 酵母菌的转化系统 E 酵母菌的表达系统 F 利用重组酵母生产乙肝疫苗 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌的分类学特征 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。 如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） 酵母菌是最简单的真核模式生物 酵母菌的宿主系统 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharoyces pombe） 汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯 德毕赤酵母表达外源基因最理想。 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因 酵母菌共有四个泛素编码基因 UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达稳定期关闭 UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达稳定期关闭 UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 对数生长期表达稳定期关闭 UBI 4 编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达 酵母菌共有七个泛素连接酶基因： UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体 UBA 1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解 Ubc4 - ubc5 双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效 酵母菌的载体系统 酵母菌克隆表达质粒的构建 酵母菌中的野生型质粒 酵母菌中的野生型质粒 酿酒酵母中的2μ环状质粒 几乎所有的酿酒酵母中都含有2μ双 链环状质粒，拷贝数达50至100 个。 IRs 反向重复序列，600 bp，重组 FLP 编码产物驱动IRs的同源重组 REP 编码产物控制质粒的稳定性 STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSR1和pSB1，以 及克鲁维酵母属中的pKD1等均与 2μ质粒类似。 酵母菌中的野生型质粒 酵母菌克隆表达质粒的构建 含有ARS的YRpp质粒的构建 ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。 以ARS为复制子的质粒称为YRp 以22μ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。 酵母菌克隆表达质粒的构建 含有CEN的YCp质粒的构建 CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列 将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1 - 5个 含有TELL的YA