工业微生物产生菌的分离筛选通过控制培养和.pdfVIP

中国试剂网 3.10.2.14 工业微生物产生菌的分离筛选（4 ） 二、通过控制培养和培养条件进行分离 各种微生物对营养要求和培养条件是不同的，在分离筛选时若在这两个方面加以 调节控制，就能获得更好的分离效果。 1.培养基的营养成分 各种微生物对碳源、氮源要求各异，有的对营养还有特殊的要求，事先了解被分 离微生物的营养要求，从而设计一个合理快速的分离培养基，能够收到事半功倍 的效果。 放线菌是生产抗生素和酶制剂的重要来源。在选择分离放线菌时，通常采用改良 的HV 琼脂培养基、土豆-胡萝卜水汁液培养基和淀粉琼脂培养基能取得较好的 效果。但不同菌种对营养要求差别很大，如奴卡氏菌在有氧条件下用普通培养基 即可分离到，而以色列放线菌则在有CO2 存在且有适宜培养基的情况下才能正 常生长繁殖。 筛选水解酶产生菌时，通常利用以底物为惟一碳、氮源的平板进行分离，如以淀 粉为碳源的培养基可鉴定菌落能否产生淀粉酶；一种含纤维素粉为碳源的分离培 养基，可以鉴别纤维素酶产生菌；用含有酪蛋白为有机氮源的平板培养基，可以 鉴别蛋白酶的产生菌。纯种分离时，把以上琼脂平板置于适宜的温度培养一定的 时间，如具有产生水解酶能力的菌株，便在菌落四周形成水解圈或呈色圈，根据 圈的大小可初步判断酶活力强弱。测定水解圈直径与菌落直径之比，把比例大的 菌落移入斜面保藏，供进一步筛选。 2.培养基的pH 细菌、放线菌的生长繁殖对pH 一般要求偏碱，霉菌和酵母菌要求偏酸。因此， 分离培养基的pH 应该调节到被分离微生物要求范围。这不仅有利于自身生长， 也可排除一部分不需要的菌类。例如，分离柠檬酸产生菌的黑曲霉，就是利用调 节培养基的酸碱度获得成功的。其分离方法是：取红芋粉醪20% 、柠檬酸10%～ 20%配成培养液，调节pH2.0～2.5 ，以一定量的培养基和土样均匀混合，用毛细 吸管点种在平皿内事先覆盖的无菌滤纸上（2～3 层），于30℃培养，这样可以分 离到产生柠檬酸的黑曲霉。 分离碱性蛋白酶和碱性脂肪酶产生菌时，可以把培养基调到pH9～11，在此范围 中国试剂网 3.10.2.14 内不宜生长的微生物被抑制，这对分离本身起到浓缩作用。大多数水解酶的生长 最适pH 基本相近，而酶的作用pH 未必与产酶pH 相同。 培养基的pH 要结合营养成分和培养条件来考虑。因为微生物在生长繁殖过程中， 由于代谢作用会产生酸性或碱性产物，pH 发生变化，微生物生长受到抑制。一 般培养基中碳氮比（C/N ）高者，培养后倾向于酸性，反之则倾向于碱性。无机 盐的性质也会影响pH 变化，（NH4 ）2SO4 是生理酸性无机氮源，其中NH4+被 菌体利用，留下 SO42—，培养液变成酸性。而NaNO3 是生理碱性氮源，其中 NO3—被菌体分解利用后，剩余Na+ ，使培养液变成碱性。如发酵过程缺氧，则 代谢向有机酸合成方向进行，pH 下降。为了维持培养基的ph ，一般要加磷酸盐， 如K2HPO4 、KH2PO4 ，使培养基具有一定的缓冲能力。如果培养液中的酸碱变 化很大，磷酸盐的缓冲容量不足以调节pH 变化，则可适当加入碳酸钙，以不断 中和菌体代谢过程中产生的酸类，使培养基的pH 能保持在恒定的范围内。此外， 在分离霉菌时，加几滴乳酸不仅可以维持一定酸碱度，而且可以抑制细菌的生长。 3.排除不需要的菌类 采取调节pH 的方法来抑制非目的微生物的生长，虽然能起到一定的作用，但并 不是对所有的菌类都有效。有些细菌和放线菌同样可以在酸性环境下生长，而个 别的霉菌，也同样可以在中性或偏碱的培养基中生长。为了更有效地抑制非目的 微生物的生长，要加入一些专一性的抑制剂。 （1）分离细菌时，在培养基中加入浓度为50U/ml 制霉菌素，可以抑制霉菌和酵 母菌的生长。 （2 ）分离放线菌时，在样品中加入 0.05%十二烷基磺酸钠（SDS ）不仅可以抑 制细菌的生长，还能激活放线菌孢子的萌发。加入氟哌酸（5mg/L ）+制霉菌素 （50mg/L ）+青霉素（0.8mg/L ）也可以有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线 菌的生长。 （3 ）分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉素和四环素各30U/ml， 可以抑制细菌和放线菌生长。 （4 ）分离根霉和毛霉时，由于这些微生物的菌丝易蔓延成片