emt核转录因子zeb1zeb2及其调节因子mir200s在大鼠肝纤维化及中药干预过程中动态表达变化研究word格式论文.docx

皮-间叶转化（EMT）调控相关因子微小 RNA200 家族成员及 E 盒结合锌指蛋白1,2（zinc-finger E-box-binding homeobox1/2，ZEB1/ZEB2）动态表达变化。方法 皮下注射四氯化碳（CCL4）复制大鼠慢性肝损伤致肝纤维化模型，分 别在 2 周、4 周、6 周和 8 周处死动物，干预组在皮下注射 CCL4 同时给予丹芍化 纤胶囊（0.5g/kg）灌胃，分别在 4 周、8 周处死大鼠；计算肝脏指数、检测大鼠 血清 ALT/AST 含量；光镜下观察肝脏病理结构变化；采用实时荧光定量 PCR 方 法检测大鼠肝组织 miRNA200s 的表达变化；采用实时荧光定量 PCR、免疫组织 化学方法、免疫印迹法(western blotting)从基因及蛋白水平检测 E 钙粘结蛋白（E-cadherin）、平滑肌 α 肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、ZEB1 与 ZEB2的动态表达变化。结果模型各组及干预 4 周组大鼠肝脏指数、ALT 及 AST 含量皆明显高于正 常对照组（P0.01）；8 周模型组大鼠肝脏光镜下可见明显肝纤维化病理改变；模 型各组大鼠肝组织中 α-SMA 蛋白及 mRNA 表达量随着肝损伤及纤维化程度加重 逐渐增加，而 E-cadherin 蛋白及 mRNA 表达量则逐渐降低；模型 2 周组中 miRNA-200a、miRNA-200c、miRNA-141 表达量皆明显高于正常对照组（P0.01)； 模型 4 周组中 miRNA-200a、miRNA-429 表达量明显高于正常对照组（P0.01)； 模型 6 周组中、miRNA200c、miRNA-141 mRNA 表达量明显高于正常对照组（P0.01)；模型 8 周组中 miRNA-200 所有成员表达量皆明显高于正常对照组（P0.01),模型 6 周、8 周大鼠肝脏组织中 ZEB1 与 ZEB2 蛋白（P0.01）及 mRNA（P0.01）表达量皆明显高于正常对照组。丹芍化纤胶囊干预 4 周、8 周组大鼠 肝组织 E-cadherin、α-SMA、ZEB1/ZEB2 表达与同期模型组存在显著性差异（P0.05）；干预 8 周组大鼠肝组织内 miR-200 表达显著低于 8 周模型组（P0.01）。 结论EMT 参与并促进了肝纤维化的发生发展；肝纤维化形成过程中 EMT的发生可能是通过 miRNA200s 与 ZEB1/ZEB2 表达变化调节的；在丹芍化纤胶囊 抑制肝纤维化发展过程中 EMT 的作用有所减轻；miRNA-200s 与 ZEB1/ZEB2 可 能是丹芍化纤胶囊抗肝纤维化作用的新靶点。第二部分 TFG-β1 诱导肝细胞 EMT 过程中 ZEB1/ZEB2 及其调节因子miRNA200s 表达的变化目的 构建转化生长因子 1（TFG-β1）诱导大鼠肝细胞发生 EMT 的模型，并 观察 miRNA200s 及其调节因子 ZEB1/ZEB2 表达变化情况。方法 将大鼠肝细胞系 BRL-3A 细胞分为 TGF-β1 处理组和对照组, 分别给 予和不给予 TGF-β1(6ng/ml)共培养,收集各组培养 0h、24h、48h、72h 等量细胞， 采用实时荧光定量 PCR 方法检测 miRNA-200s 的表达变化；采用实时荧光定量 PCR 法、细胞免疫荧光法、免疫印迹法(western blotting)从基因及蛋白水平检测 E 钙粘结蛋白（E-cadherin）、平滑肌 α 肌动蛋白（α-SMA）、ZEB1 与 ZEB2 的动态 表达变化。结果TGF-β1 处理组培养 24h 细胞较对照组 miRNA-200a、 miRNA-141 的 表达量明显减少（P0.05）；处理组培养 48h 细胞 miRNA-200a、miRNA-200b、 miRNA-200c、miRNA-141 的表达量明显减少（P0.05）；处理组培养 72h 细胞 miRNA-200a、miRNA-200b 、miRNA-200c、miRNA-141 表达量明显减少（P0.01）； TGF-β1 处理组培养 24h、48h、72h 细胞 E-cadherin 蛋白及 mRNA 表达量均较对 照组细胞表达明显减少（P0.05），且成逐渐减少的趋势；而 α-SMA 在各个时间 点细胞内均未见明显表达；TGF-β1 处理组培养 24h、48h、72h 细胞较对照组 ZEB1 蛋白及 mRNA 表达量均明显增加（P0.01），处理组培养 48h、72h 细胞较对照组 ZEB2 蛋白及 mRNA 表达量均明显增加（P0.05）。结论 TGF-β1 可诱导大鼠肝细胞上皮极性消失，促进肝细胞 EMT