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EPAS1和miR-200a调控非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药性的机制研究摘要第一部分EPAS1通过EGFR和MET信号通路调控非小细胞肺癌TKI耐药性目的：肺癌已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位的恶性肿瘤。非小细胞肺癌包括常见的鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%，其中约75%的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。近年来随着药物基因组学的开展，非小细胞肺癌的药物相关研究大幅度提升，一方面，为更好地发挥化疗效应起到指导作用；另一方面越来越多的靶向药物被研制出来，在肿瘤治疗方面起到了许多令人鼓舞的成果。在肺癌的靶向治疗、转移因素、耐药性方面我们做了许多探索。目前针对第一代靶向治疗药物EGFR-TKI,以吉非替尼和厄洛替尼为代表，对于初治的非小细胞肺癌患者，中位PFS可达10个月，随之而来的耐药性函待解决。因此相关领域一些新的蛋白基因受体研究异常火热。本研究旨在探究是否有其他因子参与了EGFR与MET的调控，我们对全基因组中HIF-1α的类似物进行了筛查。其家族成员EPAS1在EGFR调控MET中的作用我们进行了系统研究，我们将HA标记的EPAS1（HA-EPAS1）与Myc标记的EGFR（Myc-EGFR）共同转染至HCC827细胞中，并使用HA的抗体进行免疫共沉淀实验。以确认这种结合是否具有细胞特异性，同时我们在A549中进行了相同的实验。为了进一步探究EPAS1 和T790MEGFR的结合是否为直接结合，我们使用了DTME作为交联剂进行蛋白交联实验。再者，为了研究MET信号通路是否受EPAS1与T790MEGFR的相互作用影响，我们在HCC827细胞系中同时分别过表达EPAS1、野生型EGFR以及T790MEGFR，并检测MET的表达量。关于EPAS1与T790MEGFR是否依赖于配体，我们构建了配体结合域缺失的载体ΔN-T790M，并将其与EPAS1共同转染至HCC827细胞中。为了探究EPAS1与T790MEGFR的相互作用对NSCLC药物耐受的作用，我们将EPAS1与T790MEGFR共同转染至HCC827细胞中以EPAS1载体的空载作为对照，并使用吉非替尼和埃罗替尼处理细胞，用克隆实验检测分别共转染EASP1与T790MEGFR以及野生型EGFR对NSCLC对TKI处理的药物抵抗作用。最后为了探究EPAS1与T790MEGFR的相互作用是否通过MET信号通路来发挥作用的，我们敲低了内源的MET的表达并检测了细胞增殖和生长情况。方法：细胞培养NSCLC细胞系HCC827和A549购自美国ATCC（马纳萨斯）并且从收到细胞到完成文章不超过六个月时间。细胞用含10%胎牛血清，100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素，2mM-左旋谷酰胺的DMEM培养基培养，同时将细胞放入37℃含5%CO2的恒温培养箱中培养。质粒构建将EPAS1编码序列克隆到N端含HA标签的pCMV-HA质粒中，同时将配体结合域确实的突变型EGFR（氨基酸2-620）克隆到N端含Myc标签的pcDNA3.1质粒中。免疫荧光将HCC817转染HA-标记的EPAS1质粒并将细胞培养在细胞培养小室中，检测时用4%甲醛固定三十分钟，接着使用0.2%TritonX-100破膜5分钟，使用5%BSA进行封闭。使用鼠源的抗HA的一抗室温孵育并使用AlexaFluor488羊抗鼠荧光二抗室温孵育30分钟后使用DAPI作为DNA染料。在抗体孵育后，细胞用PBS清洗并用抗荧光猝灭封片剂进行封片。免疫沉淀和蛋白免疫印迹蛋白裂解使用RIPA裂解液，配方为50mMTris-HCl,pH7.4,150mMNaCl,1mMEDTA,1%TritonX-100,1%脱氧胆酸钠,0.1%SDS并添加蛋白抑制剂。将裂解完的细胞用4℃的冰冻离心机12000rpm/min离心10min，将上清与琼脂糖球体以及抗HA和抗Myc的抗体4℃共同孵育2h。将孵育后的琼脂糖珠用裂解液清洗三遍后用最终洗脱液（50mMTris,pH7.5,and50mMNaCl）清洗两遍。将琼脂糖朱用SDS上样缓冲液洗脱下来并95℃热变性5min，使用SDA胶进行蛋白分离并用转膜仪将蛋白转移到PVDF膜上。将转好的膜用PBST（PBS,0.1%Tween-20）溶解的含5%脱脂奶粉的封闭液进行封闭2h，并在4℃孵育一抗过夜。在用PBST清洗后，用含辣根过氧化酶的二抗进行孵育2h后再用PBST清洗后进行爆片。蛋白交联实验将HCC827细胞共转染EPAS1和野生型或突变型T790MEGFR后收集细胞并在4℃冰冻离心机中800g离心10min并用PBS重悬。将交联剂用DMSO溶解后备用并将其加入到细胞悬液中使终浓度为0.1mM，在4℃孵