第二章蛋白质分析技术.pptVIP

蛋白质分析技术;一、蛋白质理化性质;（二）蛋白质胶体性质;（三）蛋白质变性、沉淀;（四）蛋白质的紫外吸收;（五）蛋白质的呈色反应;第 一 节;纯化方案制定依赖因素;纯化蛋白质的通用方法;蛋白质的检测和定量;2.远紫外吸收法;3.茚三酮法;4.二辛可宁酸(BCA)法;5.双缩脲法;6.Bradford法;7.干重法;8.发射荧光法;9.Hartree-lowery法;10.结合银法;11.三氯乙酸沉淀;蛋白质检测方法;2.免疫分析;蛋白质初步回收;微生物细胞破碎;离心 过滤 双水相分离;混合静止离心;核酸和脂类的去除;浓缩和初步纯化;1.超滤浓缩;特点;2.沉淀;特点;3.离子交换层析;二、蛋白质分离纯化与鉴定的一般程序;三、蛋白质粗提前处理;1、溶剂的PH值：;蛋白质粗制品的制备;一、根据溶解度的不同（蛋白质的沉淀）;透析：利用浓度差。半透膜。;蛋白质的电泳技术;一、电泳定义 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。 电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。;二、电泳技术发展简史 ①1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。②1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。 ③1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius创造了Tiselius电泳 仪，建立了移动界面电泳（1948年诺贝尔化学奖）。 ;;⑥1967年在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。 ⑦70年代以后根据不同需要推出了多种电泳模式，如圆盘电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等。 ⑧90年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。 ;三、基本原理;四、影响迁移率的因素;3.?电场强度（E.电位梯度）：每厘米电泳支持物两端的电位降。 电场强度大，电泳速度快。但增大电场强度会引起热量增大。①样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；②产生对流，引起待分离物的混合；③引起蛋白变性；④引起介质粘度降低、电阻下降等等。 降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加。要选择适当的电场强度，同时可适当冷却降低温度以获??好分离效果。 ; ;◆按所用电压不同可分为： ?⑴?低压电泳：100V～500V，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。 ?⑵?高压电泳：1000V～5000V，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。 ◆按支持介质的不同可分为： 滤纸、薄膜、?凝胶（淀粉凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶）;◆附属设备 随着电泳技术的发展，电泳技术的种类逐渐增加，凝胶电泳在制胶、电泳系统的冷却、凝胶染色及结果分析等方面手段日趋完善，科学家们研制出各种电泳附属设备，如梯度混合仪、外循环恒温系统、脱色仪、凝胶干燥系统、凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。;六、醋酸纤维薄膜电泳;七、琼脂糖凝胶电泳;1、凝胶聚合原理;;2、优点： (1)孔径大小与生物大分子具相似数量级，具良好分子筛效应。 (2)在一定浓度范围内，机械性能好。 (3)凝胶侧链上具有不活泼的酰胺基，性能稳定，化学惰性强。 (4)具有高分辨率和灵敏度。 (5)单体纯度高，相同实验条件下，电泳结果具有很好重复性。 (6)凝胶杂质少，在很多溶剂中不溶，可适用于少量样品的制备，不致污染样品。;凝胶浓度：;蛋白质相对分子质量与凝胶浓度的关系 ;1）样品浓缩效应 2）分子筛效应 3）电荷效应;1、样品浓缩效应;电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。;缓冲液;;;; ① SDS的作用：十二烷基磺酸钠（阴离子去污剂）;;将已分离的蛋白质区带通过 电转移至硝酸纤维素薄膜上;;③ 鉴定膜上的蛋白;Marker;β-actin;;;利用具有PH梯度的电泳介质来分离等电点不同的蛋白质。;凝胶中加有两性电解质溶液 （pH9-3）;IEF;十二、染色;◆氨基黑类染色： 最早。是一类含有磺酸基的酸性染料，它通过磺酸基与蛋白质的碱性基团形成复合盐。常用的有： 氨基黑10B、萘黑12B200 、萘酚篮黑6B、水牛黑等。 这类染料对不同的蛋白质着色不同，有：蓝色、棕色、黑色， 借此可以鉴别不同类型的蛋白质。 这类染料对不同的蛋白质结合量不同，染色不均一和高背景影响蛋白质的定量。染色灵敏度较低，现在这类染料已很少应用，被灵敏度较高的考马斯亮蓝所代替。;◆考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue，简称CBB