基因操作原理-孙明知识研讨.ppt

基 因 操 作 原 理 Principles of Gene Manipulation ;绪论;目的;参考书籍;１．基因及其产物的共线性;编码区 ORF 启动子 promoter RBS ribosomal binding site 终止区 terminator flanking sequence upstream / downstream Cap/tail ;酶切;第二章 工具酶 ;一、限制与修饰 Restriction and modification ;E. coli K;E.coli K E.coli B E.coli C ;说明K和B菌株中存在一种限制系统 可排除外来的DNA 10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果 甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5‘甲基胞嘧啶 ;2. 限制酶的发现 60年代，限制内切酶和限制酶的概念 1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶 ;1970年 美国约翰·霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现 流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 能迅速降解外源的噬菌体DNA 无细胞提取液可降解E.coli DNA 但不能降解自身DNA 即HindII酶;5’ ...G T Py Pu A C... 3’ 3’…C A Pu Py T G... 5’ ;3. 限制酶的命名;3. 限制与修饰系统的种类 亚单位组成, 识别序列的种类, 是否需要辅助因子 分三类(I, II ,III) 也有分四类，IIs类，即II 亚类 ;(1) type II 93%;R : 一般为同源二聚体, 反向结合 作用在两条链 M: 单体 DNA同时切割, M只作用新链 ;type IIs 占5% 识别位点非对称, 非间断 4-7bp 切割位点可能在20bp范围内。 R: 与 type II 具有相同的辅助因子要求 M: 通常由两个M来完成,各作用一条链;(2) type I 和 typeIII type I (1%) 种类少 如 EcoR EcoB ; 识别位点 EcoB TGA*(N)8TGCT A* EcoK AAC (N6)GTGC A * 甲基化位点 °可能的甲基化位点 切割位点1000bp以外, 无特异性;typeIII (1%) EcoP1 EcoP15 识别 AGACC CAGCAG 切割 下游 24-26bp处 ;;DNA;mRNA;TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGA ;The sequence degeneracy tolerated by this enzyme has not yet been determined;其它 I-PpoI PI-TliI PI-SceI (VDE);4：Sau3AI GATC 5：EcoRII CCWGG W=A or T NciI CC SGG S=C or G 6：EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT; Not I GCGGCCGC 8 BbvCI CCTCAGC 7 PpuMI RGGWCCY 7;① 回文对称 4 6 8 5 7;② 非对称 AccBSI CCGCTC (-3/-3) BssSI CTCGTG;③ 多识别序列 (简并序列) AccI GTMKAC HindII GTYRAC;3．切割位置 ① 内部 大多数; ② 两端 EcoRII CCWGG Sau3AI GATC NlaIII CATG;TspRI CASTGNN/ NNCAC(G)TGNN NNGTG(C)ACNN ;三、限制性内切酶产生的末端;② 3’-侧→3’突出末端 5‘ recessed KpnI 　　GGTACC 　　　 　CCATGG;3.非对称突出端(相同) ① 来自非对称识别序列