第五章目的基因制取.pptVIP

A 鸟枪法 B 化学合成法 C cDNA法 本节难点和重点 反转录方法克隆目的基因的操作流程 目的基因的获得 C cDNA法 A 鸟枪法 B 化学合成法 目的基因的克隆与基因文库的构建 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。 目的基因的制取 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 染色体DNA的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载 体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为 转化受体细胞 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达 的受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立） 鸟枪法操作的改进 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 鸟枪法操作的改进 例如，已知某目的基因位于1.8 kb的Sal?片段中，将染色体DNA用Sal?切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接 在连接前将DNA片段进行分级分离 2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb 鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构 目的基因的克隆 化学合成法的基本战略 化学合成的单元操作 DNA化学合成的用途 化学合成法的基本战略 全基因合成 化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略： 小片段粘接法： 混合退火 根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 化学合成法的基本战略 全基因合成 补钉延长法： 混合退火 根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 化学合成法的基本战略 全基因合成 大片段酶促法： 混合退火 根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 化学合成法的基本战略 全基因合成 上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7% 化学合成法的基本战略 探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸 序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其 编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到 的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子 由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时 必须考虑下列问题： 生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针 探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间 探针内部不应出现可能的互补区域 化学合成法的基本战略 探针等寡聚核苷酸合成 某段连续的氨基酸序列 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile 所有可能的DNA序列 TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G