第五章 细胞融合与单克隆抗体.pptVIP

第五章 细胞融合与单克隆抗体 PEG诱导融合的特点： 优点:是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产 生的异核率较高；融合过程不受物种限制。 缺点:是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒 害。? 只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。 * * 第一节 细胞融合概述 细胞融合(cell fusion)，是指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。又称体细胞杂交(somatic hybridiazation)或细胞杂交(cell hybridization)。 一、细胞融合的定义 Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。 二、细胞融合研究进展 1972 1972 1972 1973 1974 1974 1974 1974 1974 1974 1975 1975 1975 1976 1976 1976 1978 1978 叶——叶 叶——根 愈伤组织——叶 叶——花瓣 种子——种子 叶——悬浮细胞 叶——花瓣 叶——悬浮细胞 叶——悬浮细胞 悬浮细胞——悬浮细胞 叶——根 悬浮细胞——叶 原生质体——血红细胞 悬浮细胞——叶 悬浮细胞——叶 腹水癌细胞——原生质体 叶——根尖 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞 烟草两个种间 苷蓝——青菜 大豆——马唐草 矮牵牛——龙面花 大麦——花生 大麦——大豆 小麦——矮牵牛 油菜——大豆 玉米——大豆 大豆——野豌豆 大麦——蚕豆 大豆——草香木犀 酵母菌——鸡 大豆——烟草 大豆——秋水仙 人——胡萝卜 番茄——马铃薯 人——小鼠 成功年代 细胞来源 生物种类 几种细胞融合成功的例子 三、动植物细胞的融合过程 植物细胞融合过程 人造小鼠培育过程示意图 四、细胞融合的意义 理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。 用于生产单克隆抗体、细胞疫苗等特定的生物制品。 用于基因定位和绘制人类基因图谱。 第二节 细胞融合的基本原理 显微镜下细胞融合过程 融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解 第三节 细胞融合的常用方法 一、仙台病毒法 仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段： ①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着 在细胞膜上，并使两细胞相互凝聚； ②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此 时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2； ②细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP； ④融合成巨大细胞，仍需ATP 。 病毒促使细胞融合的主要步骤如下： 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近； 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透； 两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体； 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。 用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 二、聚乙二醇（PEG）法 PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。 聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤 （1）将两种不同亲本细胞各5×l06混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与 细胞接触1分钟； （4）加9ml