荧光衍生方法.ppt

荧光衍生试剂 荧光基本原理 由于具有高灵敏度和高选择性，荧光分析被广泛的应用于化学、生物、医学等多个领域。 在生物工程中，应用荧光法进行氨基酸序列分析、碱基序列分析； 在医学领域，利用荧光分析法进行病毒的检测； B.P.EsPositol等人报道了一种检测金属的离子探针，其能灵敏高效地检测生物体内的一些金属离子。 荧光试剂 一类是荧光本源试剂，即本身具有荧光，如水杨基荧光酮和罗丹明B等。 另一类是荧光生成试剂，本身没有荧光，与被测物质反应生成具有荧光的化合物。如邻苯二甲醛在碱和硫醇同时存在的条件下和氨基酸反应生成异吲哚类具有荧光的化合物。 衍生及荧光衍生 衍生：一种物质在一定条件下不能被检测，通过一定的化学反应使之转化为能被检测的物质，这一过程就是衍生。 荧光衍生：通过衍生反应后，可以与待测物反应生成具有荧光的物质的方法。 灵敏度高，选择性好，用样量少，方法快速简单。 HPLC分离对象仅有少部分可直接用于荧光检测。 大部分的分离对象如高级脂肪酸、氨基酸、生物胺、甾族化合物和生物碱等本身不发荧光，不能直接用于荧光检测。 进行液相色谱衍生，使被测物质生成荧光物质，进行检测。 HPLC法结合荧光检测法的优点： 1）高选择性 2）高灵敏度 3）试样用量少 荧光检测器要求：被检测样品能发较强荧光 从衍生化角度分为柱前衍生、柱中衍生、和柱后衍生。 柱前衍生化 在色谱分离前，样品组分经过特定的化学反应，使之转变为荧光衍生物后进行色谱分离测定。 优点： （1）衍生反应条件不受流动相的限制，可以自由选择。 （2）如果衍生反应有较多副产物生成，可以通过进一步预处理将衍生产物与副产物分开。 缺点： (1) 柱前衍生化反应副产物可能对色谱分离造成较大难度，影响定量分析的准确性。 (2) 衍生物的降解和反应溶剂的杂质组分造成大量干扰峰。 （3）柱前衍生一般是人工操作重现性差。 柱中衍生化 通常是把衍生试剂加入到流动相中，使分析物与流动相中的衍生试剂在柱上快速反应，适合于不太稳定的衍生物。 衍生试剂需求量较大，分析成本较高。 柱后衍生 柱后衍生是将样品组分先经过色谱柱分离，然后进行荧光衍生化处理，最后进入检测器检测的方法。 缺点： (1)衍生化条件的自由度受到限制； (2)由于衍生反应在特定反应器中进行，常造成峰扩展，使分离度降低； (3)过量试剂或试剂的降解产物可能造成干扰； (4)通常需要特定的设备配件。 根据应用对象 以及目的不同 羟基衍生试剂 羰基衍生试剂 含有肼基(NH2-NH2)或氨基(-NH2)的化合物易与含有醛基和酮基的化合物发生缩合反应，分别生成相应的腙和席夫碱化合物。 因此，NH2-NH2或 -NH2可以作为羰基化合物衍生试剂的活性基团。 巯基衍生试剂（R-SH） 磺酰氯类荧光衍生试剂（DNS-Cl） 邻苯二甲醛（OPA）本身无荧光，能在2-巯基乙醇或乙硫醇存在下与伯胺、多胺反应形成荧光衍生物 荧光衍生试剂的基本要求 对于柱前衍生试剂： 1.试剂与被分析物在温和条件下定量反应生成一定衍生物； 2.在获得较高衍生产率的同时应该尽量减少衍生试剂的用量以避免试剂峰的干扰。 对于柱后衍生试剂： 1.试剂与被分析物反应迅速； 2.衍生试剂转化率高，过量少 1 衍生化反应简便快速，条件温和 2 对某一官能团友较高的选择性，衍生产物比较稳定 3 原料易得、对环境友好、合成方法简单 4 衍生试剂或产物在乙腈甲醇等常用洗脱剂中有足够的溶解度。 introduction 1 生物硫醇广泛的产生在生物组织和生理液体中，与人体的许多疾病有关。 2 HPLC-FL因其灵敏度高和简便化得到最广泛的应用。 3 本文采用SBD-BF做衍生试剂, 对半胱氨酸(Cys)，半胱氨酰甘氨酸(Cys-Gly)，同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)进行柱前衍生，HPLC分离，荧光检测。 SBD-F (ammonium 7-fluorobenzo-2-oxa-1,3-diazole-4-sulphonate) :与-SH特异反应，衍生产物稳定，易分离荧光强度大，但是衍生时间长，条件剧烈，60。C，-SH快速氧化，其它种类物质参与衍生。 SBD-BF (ammonium 5-bromo-7-fluorobenzo-2-oxa-1,3-diazole-4-sulphonate