地黄饮子孵育BMSCs移植对大鼠脑梗塞HSP70和VEGF表达的影响.docVIP

地黄饮子孵育BMSCs移植对大鼠脑梗塞HSP70和VEGF表达的影响 【摘要】目的探讨地黄饮子孵育骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal stem cells, BMSCs) 移植对大鼠脑梗塞HSP70和VEGF表达情况的影响。方法健康SPF级Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、BMSCs组、维甲酸组和地黄饮子组。用线栓法制成Wistar大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO)，术后24 h假手术组、模型组大鼠经尾静脉注射生理盐水，其余各组大鼠经尾静脉输入相应药物孵育BMSCs。分别于移植后7d和14d后断头取脑,用免疫组化法检测脑组织HSP70和VEGF蛋白的表达情况。结果与假手术组比较，模型组HSP70和VEGF表达明显升高(P0.05);与模型组比较，各治疗组HSP70和VEGF表达显著升高(P0.05)，其中药物孵育BMSCs组HSP70和VEGF表达均高于单纯血清孵育BMSCs组(P0.05)。结论促进脑组织HSP70和VEGF的表达可能是地黄饮子孵育BMSCs移植治疗脑梗塞的作用机理之一。 【关键词】 脑梗塞; 骨髓间充质干细胞; 地黄饮子; 热休克蛋白; 血管内皮生长因子　脑血管病是一种常见且后果非常严重的疾病,脑梗塞又是脑血管病中最常见者，寻找安全有效治疗脑梗塞的措施一直是近年来的研究热点。研究表明，骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植可有效保护脑缺血性损伤[1]。地黄饮子出自《黄帝素问宣明论方》，具有补肾摄阳、化痰通络之功，是治疗脑梗塞的有效药剂[2]。本文研究了地黄饮子血清孵育BMSCs移植对鼠脑梗塞脑组织HSP70和VEGF表达的影响作用，为中药与BMSCs移植联合临床治疗脑梗塞提供理论依据。 1 材料与仪器 SPF级Wistar大鼠由甘肃中医学院SPF级实验动物中心提供，动物生产合格证号：SCXK(甘)2004-0006-0000010。全反式维甲酸(RA，igma)，地黄饮子(甘肃中医学院附属医院药剂科)，低糖DMEM培养基(美国Gibco公司，批号：1240031)，胰蛋白酶(Gibco公司)，CD45、CD90荧光标记抗体，HSP70(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：sc-24),VEGF(武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA0407)。CO2恒温培养箱(SANYO，MCO-18AIC)，倒置相差显微镜(OLYMPUS，型号XDS-1B)，流式细胞仪(BECKMAN COULFER XL-100)，医学图像分析系统(成都泰盟，型号BI-2000)。 2 方法 2.1 BMSCs的分离、纯化及鉴定Wistar大鼠，体质量(120±10)g，肌肉注射水合氯醛麻醉后断颈椎处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨、肱骨，取骨髓细胞按全骨髓贴壁筛选法[3]分离、纯化BMSCs，获得细胞形态单一均匀，融合后呈典型的极性，漩涡状生长的第3代BMSCs，流式细胞仪检测CD90+CD45-细胞达到97%。 2.2 含药血清的制备将地黄饮子药材浸于10倍量常水中过夜，第2天加热煮沸lh，药渣再加入8倍量的常水煮沸45 min，将药液浓缩，使其浓度为1.0g生药/ml，于4℃冰箱保存。体质量(250±20)g Wistar大鼠10只，晚禁食，灌服药液(剂量按1g生药/100 g大鼠)，连续3 d，2次/d，于第3天给药后1h用水合氯醛麻醉动物(剂量为3.5 ml/kg)后，从股动脉取血，自然分离血清，将各组动物血清混合，56℃水浴中灭活30 min，0.22 mu;m滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。另设空白组大鼠30只，雌雄各半，晚禁食，灌服生理盐水，余方法同上制备正常大鼠血清。 2.3 大鼠BMSCs的孵育培养第3代BMSCs消化后按1times;105/ml密度接种至6孔培养板培养，待细胞70%～80%融合后，吸去10%L-DMEM培养液，随机数字表分为RA组、地黄饮子组、空白组进行培养(RA为0.5 mu;mol/L，中药组为含中药血清10%L-DMEM培养液诱导，空白组含空白大鼠血清10%L-DMEM培养液孵育)。细胞培养72 h后收集各组细胞，配制成1times;106/ml备用移植。 2.4 动物模型的制备与细胞移植参考采用改良的Longa法[4]阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血动物模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)。术后24 h对大鼠神经功能评分，参考Longa等[5]评定神经功能缺损程度的5级4分法标准进行评分，评分标准为：0分：无神经系统症状;1分：不能完全伸展对侧前爪;2分：爬行时转圈;3分：向对侧倾倒;4分：不能自行行走，意识丧失。以1～3分的大鼠入选本次研究。假手术组大鼠接受相似手术处理,但是不插入线栓。对造模成功的48只S