最新研究蛋白质与DNA相互作用.doc

一、凝胶阻滞试验 1.试验原理 又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 2.主要步骤及内容 首先是用放射性同位素标记待检测的DNA片段(亦称探针DNA)，然后同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA-蛋白质复合物。将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离。应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞蛋白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有放射性标记都将集中出现在凝胶的底部，反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。 凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性。 其办法是在DNA-蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记的竞争DNA(competitor DNA)。 如果它与同位素标记的探针DNA结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，所以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。相反地，如果反应中加入的竞争DNA并不能够同探针DNA竞争结合同一种蛋白质，于是探针DNA便仍然与特定蛋白质结合形成复合物，结果在电泳凝胶的放射自显影图片上就会呈现阻滞的条带。 在凝胶阻滞试验中使用竞争DNA，可以间接地阐明在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用。例如，使用一种具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，我们就可以判断通过特定的凝胶阻滞试验所检测到的蛋白质，是否就是属于此类转录因子，抑或是与之相关的其它因子。同样地，假如我们在竞争DNA上已知的转录因子结合位点处，事先引入一个或少数几个碱基突变，通过凝胶阻滞试验亦可有效地评估出这些突变对竞争DNA的性能及其与转录因子结合作用的影响。 二、DNaseI足迹试验(DNaseI footFIrinting assay) DNaseI足迹试验是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的准确结合位点的技术。 首先是对包含一定顺式作用元件的双链DNA进行单链标记，然后用DNaseI水解单链标记的双链DNA，产生不同长度的片断，DNA结合蛋白与其特异序列结合处由于空间位阻，DNaseI对这部分DNA不能切割，即被DNaseI保护。DNaseI水解产物经尿素变性，PAGE分离及放射性显影后，形成以相差一个核苷酸为梯度的一系列DNA条带，在此显影图中相应于DNA结合蛋白的位置上由于DNA结合蛋白的保护作用而形成了空白区域。如果在电泳时结合DNA化学测序，则可准确判断出结合区的精确序列。 三、甲基化干扰试验 根据DMS能使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理而设计。具体操作是，先用DMS处理DNA，并控制反应条件，使之达到平均每条DNA分子只有一个残基被甲基化；而后将这些局部甲基化的DNA群体同含有DNA结合蛋白的适当细胞提取物一道温育，并做凝胶阻滞试验。经电泳分离后，从凝胶中切除具有结合蛋白的DNA条带和没有结合蛋白的DNA条带，并用六氢吡啶处理之。于是，甲基化的残基被切割，不具甲基化的残基不被切割。显而易见，如果因一个G残基的甲基化作用阻止了蛋白质同DNA的结合，那么六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有同蛋白质结合的DNA分子中观察到。相反地，如果一个特殊的G残基在DNA与蛋白质的结合中不起作用，那么六氢吡啶对这个G残基的切割作用，则在同蛋白质结合的DNA分子中及不同蛋白质结合的DNA分子中均可观察到。 四、 酵母单杂交技术 酵母单杂技术是1993 年由Li et al 从酵母双杂交技术发展而来的其基本原理为: 真核生物基因的转录起始需转录因子参与。转录因子通常由一个DNA 特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成即DNA 结合结构域(DNA-binding domain BD)和转录激活结构域(activationdomain AD). 用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的录因子。GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)， 而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID 相互作