标记免疫分析讲解课件.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 第三节 其它的非放射性 标记免疫分析法 在体外分析方法中，除了放射免疫分析和免疫放射分析外，还包括其它非放射性核素标记的免疫分析。如酶标记免疫分析，化学发光免疫测定，稀土元素标记的免疫分析法等。它们与前者一样，都是利用抗原与抗体的结合具有高度特异性这一重要特性，而不同之处只是利用的标记示踪物不同，因而其标记物的测定方法也不同。它们除了与前者同样具有高度特异性及敏感性外，还克服了放射性核素可能造成的环境污染，保存期短等缺点，因此得到了广泛的应用。 一、酶标记免疫分析法 酶标记免疫分析法（enzyme immunoassay，EIA）是以酶代替放射性核素标记抗体或抗原作为主要试剂的免疫测定法。它是将抗原抗体结合的高度特异性与酶促反应的高度敏感性有机的结合起来，用酶标记抗体（抗原），检测待测标本中的未知抗原（抗体），当相应的抗原抗体特异性结合后，加入相应的酶的底物，酶可以高效专一催化和分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的有无和深浅，可以判断待测标本中有无特异性抗原（抗体）以及量的多少。本实验是一种敏感、特异、简便，只需一般光谱分析仪器的微量测定技术。 二、化学发光免疫分析法 化学发光免疫分析法（chemiluminescence‘s immunoassay，CLIA），是以化学发光物质代替放射性核素作为示踪剂，将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高度特异的抗原抗体反应结合起来的一种超微量的分析法。其特点是：设备简单，试剂稳定，无放射性污染，自动化程度高。 三、稀土元素标记的免疫分析法 稀土元素即镧系元素，其中有铕（Eu）、钛（Tb）、钐（Sm）、和镝（Dy）四种元素能发射离子荧光，这些稀土元素的螯合物，可以与抗原抗体结合，所以又称镧系荧光免疫分析。此螯合剂上的稀土元素在紫外光的激发下，可产生持续一定时间，一定光峰的荧光。而其它非特异性荧光寿命很短，待其衰减后，测量镧系元素的特异性荧光，可以完全排除背景荧光的干扰，此法又称时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluoimmunoassay，TrFIA）。 本法操作方便，灵敏度高，特异性强，无放射性，标记物稳定性好，制备简单并可长期保存，加之曲线剂量宽，自动化程度高（分析系统类似放免法）等优点，深受生物医学工作者的高度重视，目前国外生产的TRFIA 试剂盒包括甲状腺激素、类固醇激素，病毒性肝炎标记物、肿瘤相关抗原、蛋白质类、药物、多肽类和蛋白质类激素等，它们在基础医药学和临床医学各领域的应用，必将推动生物学检测技术的进一步发展，成为新一代标记免疫分析技术中的一支生力军。 四、其它免疫分析法 其它免疫分析法如半抗原标记的免疫分析法，免疫PCR技术等同学们自学。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 可以看出，这是一条随剂量增加而下降的直线。这种方法的缺点是：由于剂量取对数，0剂量在拟合时不用，所以灵敏度有损失；如果反应系统不是理想模式，用本方法处理将有较大偏差。 2、四参数Logistic模型 四参数Logistic模型是国际原子能机构（IAEA）和世界卫生组织（WHO）推荐的数据处理模型，是对Logit-Log模型的发展。其通式为： 其中X是抗原剂量，Y是结合%，a、b、c、d为四个参数。对RIA来说，a可取实验所得的最大结合率B0，b可取同一批数据用Logit-Log法作线性回归所得的斜率，c可取使B0下降一半所需抗原浓度ED50，d可取实验所得NSB。四参数Logistic模型的图形如图： 3、其他拟合模型 如四参数单位点作用模型的稳定性较好，个别标准管出现坏点对拟合结果的影响较小；还有二次多项式拟合法、折线拟合法等。应当指出，不论采用何种数学模型进行曲线拟合，实验的结果应该是相同的或相近的，都不能改善实验过程低劣所带来的影响。 六、RIA的分析误差和质量控制 RIA是一类高灵敏度的超微量分析技术，易受各种因素的影响而使检测结果失真。因此，质量控制体系应包括生产及使用两个重要环节。作为生产厂家，应建立严格的质量检测程序，以保证进入市场的产品都符合质量要求，这是首要环节。作为用户则应建立严格的质量控制体系，以保证检测的质量。根据不同的目的，质量控制体系可分为实验室内部质量控制和实验室间质量评价。 （一）误