哺乳动物基因工程讲解课件.pptVIP

四、高等哺乳动物的基因转移 一、 高等哺乳动物基因工程的基本概念 二、 高等哺乳动物的受体系统 三、 高等哺乳动物的载体系统 四、 高等哺乳动物的基因转移 五、 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白 （二）哺乳动物细胞的病毒转染法 以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒 共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导 入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围 有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。 1.哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 2.利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体 3. 利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂 4. 利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊 方式。氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶 数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩 增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶 通过强化基因扩增高效表达外源基因 （DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多 的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区 哺乳动物细胞内的基因扩增现象 域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 通过强化基因扩增高效表达外源基因 DHFR-MTX高效表达系统 外源基因 dhfr 转染dhfr -细胞系 单克隆 培养 转移 0.05 mM MTX 培养 单克隆 转移 培养 单克隆 转移 5 mM MTX 0.25 mM MTX 培养 单克隆 外源基因扩增至100拷贝 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 通过强化基因扩增高效表达外源基因 GS-MSX高效表达系统 谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亚砜（MSX）对动物细 胞的毒害作用。先将带有GS编码基因的载体转入培养的哺乳动物细 中不必使用GS缺陷型的受体细胞，而且在正常的MSX浓度下就能筛 选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR- 胞中，由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程 MTX系统优越之处。 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 通过强化基因转录高效表达外源基因 在载体上安装病毒或细胞来源的强启 Ap r M13 ori ColE1 ori CMVP Polylinker Gene Intron SV40 T PolyA signal 高效表达载体 mRNA前体 AAAAAAAAA mRNA 动子以及有效的翻译元件，也是使外源基 因高效表达的一种手段，如： 细胞巨化病毒CMV的启动子 动物珠蛋白基因的内含子 SV40的终止子和polyA化信号序列 绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体 上携带内含子结构，因为mRNA前体的剪 切能促进成熟mRNA向胞质的运输，有利 于翻译。有的还含有各种信号肽序列。 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白 迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但 在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种： b 干扰素 g 干扰素 凝血因子VIII 凝血因子IX 促红细胞生成素（EPO） 生长因子（hGH） 白介素 2（IL-2） 乙型肝炎表面抗原 单克隆抗体 CD4受体 组织型纤溶酶原激活剂（tPA） * * 第十六章 哺乳动物基因工程 三、高等哺乳动物的载体系统 二、高等哺乳动物的受体系统 一、高等哺乳动物基因工程的基本概念 五、利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白 第六节 哺乳动物基因工程 高等哺乳动物基因工程 高等哺乳动物细胞基因表达技术 高等哺乳动物转基因技术 转基因动物个体 动物工程细胞 哺乳动物遗传性状改良 药物筛选研究评价模型 人体基因治疗 蛋白多肽物质大规模生产 药物筛选研究评价模型 1、高等哺乳动物细胞的生长特性 2、高等哺乳动物受体细胞的条件 3、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 4、常用的高等哺乳动物受体细胞 第十六章 哺乳动物基因工程 1、高等哺乳动物细胞的生长特性 正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征： 锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑